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研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GB)为颅内最常见原发性恶性肿瘤,尽管目前以手术联合放化疗的综合治疗方法已成为指南,但GB患者预后仍未改善,术后极易复发。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是目前GB治疗一线化疗药,但TMZ耐药是制约胶质瘤化疗疗效并导致治疗失败的重要原因。既往研究显示结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)差异表达与肿瘤耐药存在相关性,然而其在胶质瘤TMZ耐药中具体调控机制尚不明确。本研究拟深入探讨CTGF介导的胶质瘤TMZ耐药调控网络,以期丰富胶质瘤耐药分子调控机制,为胶质瘤TMZ耐药机制阐明及临床逆转提供依据。主要研究内容[目的]明确CTGF在胶质瘤TMZ耐药进程中所扮演的角色;证实CTGF可通过干性获取调制胶质瘤细胞TMZ耐药;并深入阐明TGF-β信号激活促进CTGF表达介导胶质瘤TMZ耐药的分子调控机制。[方法]采用免疫组化、qRT-PCR等分析CTGF表达与胶质瘤耐药的相关性;应用慢病毒干扰或过表达等功能性研究CTGF表达对胶质瘤TMZ耐药的影响;通过肿瘤球形成、流式细胞术等探讨CTGF与肿瘤干性表达的相关性;运用ELISA、Western blot等深入阐明TGF-β信号激活促进CTGF表达介导胶质瘤TMZ耐药分子机制。[结果]1)药物敏感性分析发现,体外构建的胶质瘤TMZ耐药细胞IC50在1.5-2.0mM间,其耐药性显著高于亲本细胞(1.0mM);qRT-PCR、Western blot检测提示,胶质瘤TMZ耐药细胞显著高表达ABCB1、ABCC、BCRP及MGMT耐药相关表型基因与蛋白。2)耐药细胞基因芯片分析与筛选发现,CTGF在胶质瘤TMZ耐药细胞中差异高表达(上调9.14倍);临床胶质瘤组织样本检测证实CTGF表达与胶质瘤恶性分级、肿瘤耐药性呈正相关关系。3)TMZ处理促进体外胶质瘤细胞CTGF mRNA与蛋白表达,且具有明显的时间与浓度依赖。4)干扰CTGF抑制胶质瘤细胞克隆形成能力,提高胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性,增强TMZ诱导的细胞凋亡蛋白C-PARP表达;裸鼠皮下成瘤实验发现干扰CTGF抑制体内胶质瘤的生长及肿瘤形成。5)过表达CTGF增强并回复TMZ预处理后胶质瘤细胞克隆形成能力,下调胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性,并降低TMZ凋亡诱导;过表达CTGF促进裸鼠皮下成瘤,下调C-PARP表达,增强胶质瘤对TMZ化疗耐药。6)CTGF上调胶质瘤细胞肿瘤干性基因ALDH1、CD44、Nestin、Nanog的表达,增强胶质瘤细胞肿瘤球形成能力,促进CD44+细胞表达与蛋白表达;siCD44共转染分析发现,干扰CD44抑制过表达CTGF胶质瘤细胞肿瘤球形成能力,逆转CTGF介导的胶质瘤TMZ耐药性。7)ELISA与qRT-PCR检测结果显示TMZ促进胶质瘤细胞TGF-β1表达上调,且具有一定的浓度依赖;免疫荧光提示TGF-β1与CTGF存在共表达关系;联合TGF-β中和抗体或抑制剂SB431542逆转TMZ诱导的CTGF表达上调,而加入rTGF-β1因子促进胶质瘤细胞CTGF蛋白表达。8)TMZ促进胶质瘤细胞Smad3与ERK1/2蛋白磷酸化;瞬时干扰Smad3与ERK1/2下调胶质瘤细胞CTGF蛋白表达,同时逆转过表达CTGF引起的TMZ耐药;裸鼠皮下成瘤实验证实胶质瘤化疗过程中TMZ促进胶质瘤耐药性产生,且与TGF-β1-Smad3/ERK1/2-CTGF信号通路激活密切相关。[结论]1)耐药细胞模型与临床组织样本证实CTGF与胶质瘤耐药密切相关。2)体外TMZ处理促进胶质瘤细胞CTGF表达;下调胶质瘤细胞CTGF表达促进TMZ化疗增敏与细胞凋亡;而过表达CTGF促进胶质瘤TMZ化疗耐药,细胞凋亡调制参与了这一过程。3)CTGF促进胶质瘤细胞肿瘤干性表达,靶向肿瘤干性调制CTGF介导的胶质瘤TMZ耐药性改变。4)TGF-β1信号激活促进TMZ诱导的CTGF表达上调,Smad与ERK信号参与TMZ诱导的TGF-β1/CTGF信号轴在胶质瘤TMZ耐药中的激活。