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研究背景:失重/模拟失重暴露时,血管将发生区域特异性的结构与功能重塑,具体表现为:流体静压参考点水平以上动脉管壁增厚,收缩功能增强;参考点以下动脉管壁变薄,收缩功能减弱。最新研究表明,6个月航天飞行后,航天员颈总动脉(common carotid artery,CA)出现明显的纤维化,僵硬度增加17-30%。CA主要供应头面部血流,若CA出现结构或功能异常,往往导致中风,并可能与冠心病、糖尿病等严重问题相伴随,因此颈总动脉僵硬度增加被医学界公认为心脑血管疾病的独立危险因子之一[1]。因此,上述发现提示失重所致CA纤维化改变可能对航天员在轨和返回后的工作能力甚至身体健康造成威胁,需对其机制进行研究并提出相应防护措施。血管纤维化主要表现为管壁的厚度增加和细胞外基质的过量沉积。胶原纤维是细胞外基质的主要成分,它作为支撑血管细胞的网架组织,维持着动脉管壁的弹性。胶原纤维主要由胶原蛋白(collagen,COL)构成,其含量增多是动脉僵硬度增加的重要特征[2]。已有证据证明,血管壁COL处于不断合成和降解的过程中,合成增加或降解障碍均会导致其含量增加。COL降解主要由两条途径:一是经由基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs);二是经由自噬过程分解。MMPs是由一系列结构相似的蛋白水解酶组成的蛋白酶家族[3],通过分解细胞外基质各种成分影响结缔组织的重塑和修复[4]。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)作为分解血管壁中胶原纤维的主要酶类,它的减少是预测血管僵硬度增加的重要指标[5]。人体内存在金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP1),负责特异性抑制MMP9的活性[6,7]。因此MMP9减少或TIMP1增加均可导致COL增加和动脉纤维化改变。但CA中的MMP9和TIMP1在失重/模拟失重环境下如何改变?它们在动脉纤维化改变中发挥何种作用?目前并不清楚。自噬是一种利用溶酶体对自身蛋白质和细胞器进行分解、将大分子物质予以回收利用的高度保守的降解过程。近年来,国内外研究发现自噬是COL降解的主要机制之一,其活性降低可促进肝、肺、肾、血管等多种组织COL沉积和纤维化改变[8,9]。神经酰胺(ceramide,Cer)是鞘脂代谢的中心分子,在凋亡、增殖、氧化应激等中多种细胞过程中发挥重要作用,可通过促进溶酶体运动、抑制营养物质转运、改变自噬基因表达等多种途径调节自噬过程,我们前期研究发现尾部悬吊模拟失重大鼠CA中酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASM)蛋白表达及Cer含量均显著降低。但模拟失重大鼠CA自噬如何变化?在动脉纤维化改变中发挥何种作用?其上游调控是否与Cer有关?尚无研究报道。实验目的:1.阐明尾部悬吊模拟失重大鼠CA纤维化改变的时程特征。2.观察模拟失重大鼠CA中MMP9途径变化。3.观察模拟失重大鼠CA自噬变化及在动脉纤维化改变的作用。4.探讨模拟失重大鼠CA中Cer改变对自噬和动脉纤维化的调控作用。实验方法:1.采用尾部悬吊(hindlimb unloading,HU)大鼠模型模拟失重对心血管的影响,分别取悬吊0天(day,d)、3d、1周(week,w)、2w、4w五个时间点取材CA。2.运用透射电镜、免疫蛋白印迹技术(western bloting,WB)、免疫组织化学染色(immunohistochemistry stain,IHC)、马松三色染色(Masson trichrome staining,Masson)、测量血管张开角等实验方法测量血管纤维化水平。3.采用透射电镜、WB检测大鼠CA自噬水平变化。4.采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测大鼠CA中I型胶原蛋白(collagen I,COLI)基因表达变化。5.注射自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RA)、自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)和钙通道激动剂去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)后,检测大鼠CA纤维化和自噬改变。6.WB检测大鼠CA中ASM、中性鞘磷脂酶(neutral sphingomyelinase,NSM)和酸性神经酰胺酶(acid ceramidase,AC)的蛋白含量改变,IHC检测Cer水平改变。7.ASM抑制剂多塞平(doxepin,DOX)灌胃和AC抑制剂卡莫氟(carmofur,Car)腹腔注射后,检测CA中Cer含量变化、自噬和纤维化改变。实验结果:1.尾部悬吊模拟失重大鼠CA纤维化改变的时程特征与对照组(control group,CON)相比,HU大鼠CA张开角显著减小(P<0.05),且随着悬吊时间的延长,其减小程度逐渐增加,其中以4w HU变化最为明显。Masson及IHC结果显示,与0d HU大鼠相比,3d HU、2w HU和4w HU大鼠CA胶原纤维面积比明显增加(P<0.05);WB结果显示,与3d HU大鼠相比,2w HU和4w HU大鼠COLI均明显增加(P<0.05)。透射电镜结果显示,4w HU大鼠CA平滑肌细胞体积与CON相比无明显变化,但间质面积显著增加(P<0.05),胶原纤维比例亦显著增多(P<0.05)。q RT-PCR实验结果显示与CON相比,4w HU大鼠COLI基因表达显著增加(P<0.05)。2.模拟失重大鼠CA中MMP9途径改变与CON相比,HU大鼠CA中MMP9的m RNA表达量无明显改变,而蛋白表达量和酶活性皆下降(P<0.01);TIMP1的基因和蛋白表达量则显著增加(P<0.01)。3.模拟失重大鼠CA自噬水平的改变及对动脉纤维化的影响与CON相比,HU大鼠CA平滑肌细胞自噬小体数量显著减少,而Beclin1、P62和微管相关蛋白轻链3B(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B)蛋白表达显著增加(P<0.05)。给予大鼠RA以促进自噬小体形成后,CON和HU大鼠CA自噬相关蛋白、COLI蛋白表达及血管张开角均无明显改变;CQ处理抑制自噬小体与溶酶体结合后,CON大鼠CA自噬相关蛋白、COLI蛋白表达增加(P<0.05),血管张开角显著减小(P<0.05),HU大鼠则未见明显改变;而在NE处理促进自噬小体与溶酶体结合后,HU大鼠CA自噬相关蛋白、COLI蛋白表达降低(P<0.05),血管张开角显著增加(P<0.05),CON未见明显改变。q RT-PCR结果显示,RA,CQ和NE对CON和HU大鼠CA中COLI m RNA表达均无明显影响。4.模拟失重大鼠Cer的改变及其在自噬与动脉纤维化中的作用与CON相比,HU大鼠CA中ASM蛋白表达显著减少、AC蛋白表达显著增加(P<0.05),NSM未见明显变化,Cer含量显著减少(P<0.05)。ASM抑制剂DOX灌胃后,CON大鼠CA中Beclin1、P62和LC3B蛋白表达显著降低(P<0.05),COLI m RNA和蛋白表达均增加(P<0.01),血管张开角减小(P<0.05),而HU大鼠CA中自噬和纤维化水平均无显著变化;腹腔注射AC抑制剂Car后,HU大鼠CA中Beclin1、P62和LC3B蛋白表达显著降低(P<0.05),COLI m RNA和蛋白表达均减少(P<0.05),血管张开角增加(P<0.01),而CON大鼠CA中自噬和纤维化水平均无明显改变。实验结论:实验结果表明,尾部悬吊模拟失重导致大鼠CA中胶原蛋白含量增多、纤维化改变和僵硬度增加,并呈时程依赖性变化;MMP9水平降低,TIMP1水平升高;自噬水平降低,ASM降低、AC增加,Cer含量减少。提高ASM或降低AC表达以增加Cer含量可明显提高自噬水平并显著减少动脉COL含量、减轻纤维化程度。提示在模拟失重的条件下,MMP9途径以及Cer调控自噬途径通过介导COL降解障碍在模拟失重大鼠CA纤维化改变中发挥重要作用。