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捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）是一种寄生于反刍动物（山羊、绵羊、牛及骆驼等）真胃的食血性线虫,在全球范围内流行,可以导致宿主贫血、消瘦、腹泻、生长发育不良甚至死亡,严重危害养殖业的发展。非编码RNA是一类不编码蛋白的RNA,包括短链非编码RNA和长链非编码RNA,广泛存在于生物体中,具有发育阶段和组织特异性的表达特点,在转录或转录后水平严格调控基因的表达,参与细胞增殖、分化、疾病的发生发展以及免疫应答等多种生物学过程,引起广大研究学者的兴趣。相关研究表明虫体包括不同发育阶段的复杂性与基因表达调控息息相关,非编码RNA已在其他领域内取得了一定的进展,然而对捻转血矛线虫非编码RNA的研究还相对比较欠缺。因此,开展非编码RNA的研究,有助于更好地理解虫体在不同的环境中生活、生存的调控机理以及发现可能的新的生物学特征,同时也有助于为有效防控捻转血矛线虫病提供更好的策略和方向。本研究的主要内容如下:1.捻转血矛线虫感染性三期幼虫和雌雄性成虫环状RNA表达谱的鉴定分析构建感染性三期幼虫、雄虫及雌虫的去rRNA及线性RNA的链特异性文库,共鉴定到20073个环状RNA,可以分为外显子型、内含子型及基因间区型,广泛分布于捻转血矛线虫的6条染色体,而X染色体上的数目最丰富,83.48%的环状RNA长度在200～600 nt之间,94.8%的外显子型环状RNA中外显子数目少于5个,41.74%的亲本基因仅转录生成单独的环状RNA。雌雄虫相比,637个环状RNA显著上调,482个显著下调;雌虫与三期幼虫相比,1707个环状RNA显著上调,14241个显著下调;雄虫与三期幼虫相比,1356个环状RNA显著上调,15491个显著下调,GO富集分析表明差异表达环状RNA的亲本基因显著富集于许多生物学过程中,主要包括信号转导、细胞通讯等,KEGG分析显示,主要与代谢（丙酮酸代谢、甘油磷脂代谢和碳代谢）、MAPK信号通路和磷脂酰肌醇信号系统有关。通过miRanda软件预测了环状RNA与miRNA的结合能力,共得到12015关系对和8268个节点,大部分环状RNA针对特定的miRNA只有1～2个结合位点。设计“离散型”引物和“聚合型”引物,分别以cDNA与gDNA为模板,通过PCR扩增,Sanger测序,成功验证了 24个环状RNA剪切位点和可变剪切特征的可靠性,挑选不同时期差异表达环状RNA,通过qRT-PCR成功验证了测序数据的准确性以及对RNase R消化的耐受性。2.捻转血矛线虫雌虫肠道组织全转录组鉴定与分析构建雌虫肠道组织去rRNA的链特异性文库和small RNA文库,共鉴定到4846个长链非编码RNA,982个环状RNA以及96个miRNA（65个已知的和31个新的）,还有8821个蛋白编码转录本,长链非编码RNA可分为内含子、反义、基因间三类,与mRNA转录本相比,其序列更短,外显子更少,表达水平更低,序列分析结果表明只有LNC001632与秀丽新杆线虫、人、斑马鱼、酵母及果蝇的长链非编码RNA有保守性;平均长度为356bp的环状RNA也包括三种类型（外显子、内含子和基因间）,倾向于分布在X染色体上,69%的亲本基因只产生一个环状RNA转录本,907个环状RNA与雌虫的环状RNA有保守性,363个具有相同的序列;在已知的miRNA中,第一位碱基是U的比例为92.1%,在新鉴定的miRNA中,第一位碱基是U的比例为93.1%,对于新miRNA,前体miRNA的长度范围为44～78 bp,平均长度为58 bp,且具有特有的茎环结构,9个新的miRNAs（novel-2/5/8/16/22/33/60/69/75）与已知miRNAs共享种子序列,在miRB ase数据库中,6个新miRNAs（novel-19/20/45/53/72/89）的种子序列与其他寄生线虫（Ascaris suum,Brugia malayi,Caenorhabditis elegans,Heligmosomoides polygyrus,Strongyloides ratti）miRNA的种子序列一致,此外,还鉴定出4个新种子序列（novel-101/25/29/49）。基于长链非编码RNA可能顺式（cis）调控邻近基因,通过搜索其上下游100 kb的编码基因,共鉴定到8265个靶基因,攻能分析发现它们主要参与蛋白结合、细胞内解剖结构、细胞器和细胞过程;环状RNA的宿主基因主要富集于分子功能类,如核糖核苷酸结合、核苷酸结合、ATP结合和碳水化合物衍生物结合;miRNA靶基因与细胞过程、细胞对刺激的反应、细胞蛋白修饰过程和信号转导有关。构建了长链非编码RNA、环状RNA、miRNA及mRNA之间的调控网络图,其中miRNA可以靶向1678个mRNA、2546个长链非编码RNA以及277个环状RNA。3.HcAGO基因家族全基因组鉴定及HcAGO2功能研究利用秀丽新杆线虫AGO基因家族信息,根据BLAST和HMMER搜索,在全基因组水平鉴定到捻转血矛线虫有9个AGO基因,分别是HCON 00127260、HCON00012640、HCON00159190、HCON00049320、HCON00004060、HCON00047450、HCON00162700、HCON00030260 和 HCON00028030,分布于4条染色体上,系统发育分析结果显示包括三个亚家族（AGO亚家族、PIWI亚家族以及WAGO亚家族）,转录组分析显示基因在虫卵和雌虫中转录水平相对较高,在其他阶段相对较低,表明它们可能在虫卵发育方面发挥一定作用。制备了抗HcAGO2（HCON00127260）蛋白的多克隆抗体,但是抗体不能识别虫体的内源性蛋白,具体原因有待进一步探究,RNA干扰实验表明Hcago2转录水平的降低可显著导致感染性三期到四期幼虫的发育率下降。综上所述,本研究分析了感染性三期幼虫、雌虫及雄虫的环状RNA表达谱特征和可能的生物学功能,构建了虫体由自由生活阶段向寄生生活阶段转变过程中相关基因的调控网络,此外,揭示了雌虫肠道组织长链非编码RNA、环状RNA和miRNA的表达特征,最后,确定了HcAGO基因家族成员并探究了HcAGO2在虫体发育过程中发挥的功能,研究结果有助于增强对虫体生物学的了解,也为后续研究捻转血矛线虫调控型非编码RNA功能提供基础和数据支持。