【研究背景和目的】木香为菊科多年生草本木香Aucklandia lappa Decne的干燥根,其成分主要有挥发油、甾醇类、生物碱、有机酸等。基于活性导向的分段筛选策略,我们发现木香挥发油(Volatile Oil from Saussurea lappa Decne,VOSL)是木香的抗癌活性成分,其中木香烃内酯(Costunolide,Cos)和去氢木香内酯(Dehydrocostus lactone,Dehy)是VOSL最主要的组成成分,这两个活性成分的含量约占VOSL总含量的75%。国内外众多研究显示,Cos和Dehy在抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抑制血管收缩和免疫调节等方面都有非常好的药理功效。更重要的是,我们前期还发现,Cos和Dehy在体内具有协同抗肿瘤的效果,VOSL给药组与(Cos-Dehy)联合给药组对裸鼠MCF-7乳腺癌移植瘤均具有显著的抑制作用,作用效果优于Cos或Dehy单个化合物给药。此外,VOSL不仅能抑制MCF-7移植瘤的生长,还能保持荷瘤裸鼠的体重和活力,这对于裸鼠的“荷瘤生存”具有重要意义。中药治疗癌症尽管有着悠久的应用历史,但迄今并未成为癌症治疗的主流手段,究其原因,有一点非常重要,就是中药的单方或复方化学成分非常复杂,这将会导致其活性成分不清楚,药理机制不明确,质控和现代工业化生产困难,因此很难被现代的医药体系(尤其是西方国家)所接受。中药现代化,就是要尽量保持中药“多成分、多靶点、系统治疗”特点的同时,朝着活性成分清楚、药理机制明确、质量可控的方向努力。某种程度上说,中药木香因其化学成分复杂,就像一个“黑箱”,而VOSL的化学成分则要简单得多,其主要成份即为Cos和Dehy,因此VOSL如同一个“灰箱”,Cos和Dehy是化学结构明确的单个化合物,其药理机制的研究相对清晰,如同一个“白箱”。本项目以VOSL治疗肝癌为研究对象,采用从“白箱→灰箱→黑箱”逐级递进的研究思路,来评价VOSL抗肝癌的药效并探索其作用机制,为“多成分、多靶点、低毒性”的新型抗癌药VOSL注射液的开发提供基础数据。同时,通过本项目,我们希望能阐明中药木香的抗癌作用机制,为我国的中药现代化战略做出一点贡献。【研究方法】1.筛选敏感细胞系:通过细胞增殖实验MTT方法筛选出对木香挥发油VOSL及其有效活性成分敏感性较强的细胞系。在SMMC-7721、Hep3B、Hep G2、Huh-7、HCC-LM3、L02、WRL-68细胞系中,选定SMMC-7721和Hep3B细胞系进行细胞学实验。2.细胞克隆与细胞周期:将SMMC-7721和Hep3B细胞经过Cos、Dehy、C+2D(Cos+2Dehy)及VOSL处理48h后,采用细胞克隆及流式细胞术研究各测试组对肝癌细胞克隆形成及细胞周期分布的影响。3.细胞凋亡:将上述细胞经过Cos、Dehy、C+2D及VOSL处理48h后,采用Hoechst 33342和流式细胞术实验,从定性和定量上检测各测试组对肝癌细胞凋亡的影响。4.细胞迁移与侵袭:将上述细胞经过Cos、Dehy、C+2D及VOSL处理48h后,采用细胞划痕和Transwell侵袭实验检测各测试组对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响。5.细胞蛋白表达的变化:收集各测试组处理48h后的细胞,提取总蛋白,通过Western blot实验方法检测与凋亡和侵袭相关的蛋白因子表达的变化。6.动物模型的建立:选择较为敏感的肝癌细胞SMMC-7721建立裸鼠皮下移植瘤模型,给予Cos、Dehy、C+2D、VOSL及5-Fu进行治疗,观察各治疗组对肿瘤的生长和荷瘤裸鼠的影响,治疗结束后,取移植瘤标本,制备石蜡切片,通过免疫组化实验方法检测相关蛋白表达的变化。【研究结果】(一)木香挥发油VOSL对肝癌细胞生物学行为的影响1.VOSL、Cos和Dehy对SMMC-7721、Hep3B、Hep G2、Huh-7等肝癌细胞的增殖都具有一定的抑制作用,其中SMMC-7721和Hep3B(VOSL作用的IC50分别为6.202±0.337、5.405±0.210μg/ml)最为敏感,而对正常肝细胞WRL-68和L02抑制能力最弱。2.肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B经过VOSL、Cos、Dehy、C+2D处理48h后继续培养14天,与对照组相比可明显观察到各测试组对两种肝癌细胞的克隆形成均有抑制作用。3.各测试组对两种肝癌细胞的周期分布都有明显的影响,在SMMC-7721细胞中,S期剂量依赖性增加,伴随G0/G1和G2/M期的减少;同时在Hep3B细胞中,经过Cos处理也表现出相似的结果,而经过VOSL、Dehy、C+2D处理后,除了S期增加,G2/M也相应地增加,伴随G0/G1的减少。4.Hoechst 33342结果显示,SMMC-7721和Hep3B两种细胞系经过VOSL、Cos、Dehy、C+2D分别处理后,细胞核激发的荧光强度与对照组相比明显增强,同时可观察到细胞核固缩,呈现出典型的月牙状,从形态上表明各组化合物均有诱导肝癌细胞凋亡的作用。5.流式细胞术从定量上分析了各测试组对肝癌细胞凋亡的影响,结果显示,随着浓度的增加,SMMC-7721和Hep3B细胞的凋亡率依次上升,明显高于对照组(3.46±0.69)%和(8.66±1.74)%,当浓度达到IC50时,各测试组凋亡率均达到50%以上,成剂量依赖性,且主要表现在早期凋亡。6.各测试组以低浓度处理SMMC-7721和Hep3B细胞,通过划痕实验可明显观察到VOSL、Cos、Dehy、C+2D对肝癌细胞迁移的抑制作用。7.Transwell侵袭实验证实,各测试组均有抑制肝癌细胞侵袭的能力。(二)木香挥发油VOSL对细胞凋亡及侵袭相关蛋白表达的影响1.Western blot检测各测试组凋亡相关蛋白表达的变化,结果显示,VOSL、Dehy、C+2D处理后,SMMC-7721和Hep3B细胞cleaved-Caspase3的表达有明显上调的趋势,同时Caspase3的表达明显下调,且呈剂量依赖性;经过Cos处理后,在两种细胞中cleaved-Caspase3和Caspase3蛋白表达没有明显的变化。结果表明Cos对诱导肝癌细胞凋亡的机制可能与VOSL、Dehy、C+2D有所不同。2.Western blot检测侵袭相关蛋白MMP-9的表达,与对照组相比,经过处理后SMMC-7721和Hep3B细胞中MMP-9表达均明显下调。3.经VOSL、Cos、Dehy和C+2D分别处理后,在SMMC-7721和Hep3B细胞中MMP-9的上游信号蛋白P38的磷酸化水平明显下调,而p-ERK的表达水平没有明显的变化;同时在VOSL、Dehy、C+2D测试组发现Akt的磷酸化水平也表现出下调的趋势。4.经VOSL、Cos、Dehy和C+2D分别处理后,发现P38和Akt的上游信号蛋白EGFR的磷酸化水平受到明显的抑制,推定VOSL通过抑制EGFR信号通路,抑制了肝癌的发展。(三)木香挥发油VOSL对SMMC-7721裸鼠移植瘤的疗效研究1.肝癌SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤成瘤后,经过Cos、Dehy、C+2D、VOSL及5-Fu以15mg/kg/天的量腹腔注射治疗后24天,可观察到各治疗组移植瘤生长速度明显低于NT对照组,其抑瘤率分别为23.15%、30.23%、37.51%、55.71%和42.22%,发现VOSL治疗组的抑制作用最为明显。2.TUNEL法标记各治疗组移植瘤组织中的凋亡细胞,结果显示VOSL、Cos、Dehy及C+2D各治疗组的凋亡阳性细胞数较NT对照组多,且VOSL治疗组阳性细胞最多,这与VOSL治疗荷瘤裸鼠的效果相一致。3.免疫组化检测移植瘤组织中Ki67、p-P38、p-Akt和p-EGFR的变化,发现与对照组相比,各治疗组Ki67、p-P38、p-Akt和p-EGFR的表达明显降低,且VOSL治疗组表达最少,推论VOSL是通过抑制EGFR信号通路,抑制了肝癌的发展。【研究结论】本课题在细胞学以及动物水平上研究木香挥发油VOSL以及它的主要活性成分对肝细胞癌的作用及其机制。实验结果表明,VOSL、Cos、Dehy和C+2D在体外均具有明显的抑制肝癌细胞的增殖及诱导肝癌细胞凋亡的活性作用,在低浓度条件下,可抑制肝癌细胞迁移与侵袭。VOSL以及它的主要活性成分能够引起肝癌细胞SMMC-7721和Hep3B内p-EGFR水平的下降,导致下游与侵袭、凋亡密切相关信号通路的蛋白P38和Akt磷酸化水平的下降,从而削弱肝癌侵袭与转移的能力、诱导肝癌细胞的凋亡。通过皮下成瘤实验验证VOSL抗肿瘤活性,证实VOSL可以延缓模型肿瘤的生长速度,且VOSL的抑瘤效果较C+2D好,说明VOSL内可能存在另外的物质在体内对肝癌移植瘤有抑制作用,而这种猜测还有待进一步的研究。