我国矿产资源的显著特点是品位低、复杂、难处理和中小型矿居多,传统的选冶工艺很难进行经济、绿色、有效地提取。生物冶金具有低成本、短流程、污染小等优点,具有广阔的应用前景。浸矿微生物浸出一段时间之后,其生长的环境中就会富含高浓度的硫酸盐及有毒重金属离子,这是制约其浸出时间、浸出效率的重要的环境因素。而在微生物的解毒机制中,硫酸盐的同化途径可能发挥了重要的作用,因而对于浸矿微生物重金属的抗性机制,以及硫酸盐同化与重金属解毒耦合作用机制的研究,对微生物适应极端环境的分子机制的揭示,对浸矿过程中,重金属的耐受和浸矿效率的提高,以及在环境领域更广阔的应用其抗性机制,都将具有非常重要的意义。本文旨在对浸矿微生物的重金属抗性机制进行深入的探索,研究浸矿微生物的重金属抗性以及与硫酸盐同化的内在联系,研究工作主要有以下几个方面：①浸矿微生物重金属抗性机制的初步探索在本研究给定的重金属浓度下, A. ferooxidans表现出了明显的抑制作用并且随着重金属浓度的增加,抑制作用越明显。适合研究的Cd2+、Zn2+、Pb2+三种重金属耐受浓度分别为Cd2+(5mM、15mM、30mM), Zn2+(150mM、300mM、600mM), Pb2+(2.5mM、5mM、10mM)。在Cd2+胁迫下,通过测定镉离子的亚细胞结构镉离子含量、细菌细胞体内GSH的含量、硫酸根离子浓度、硫酸盐同化途径的相关酶类的酶活,结果表明其可能存在的抗性机制有细胞累积、排出系统、以及生物转化或螯合等几种方式。在Zn2+胁迫下,通过测定菌体内GSH的含量、Cys含量、硫酸盐同化途径的相关酶类酶活,结果表明,随着Pb2+浓度的增加,其体内GSH含量有所增加,Cys含量的变化不明显,硫酸盐同化途径的相关酶类也有所变化,但是却是表现为先增加后降低,说明硫酸盐同化途径可能对锌离子的抗性有一定的作用,但是在浓度更大的情况下,硫酸盐同化途径可能已经不能满足细菌菌体的需要,其可能启动了更多的重金属抗性机制。在Pb2+的胁迫下,通过测定菌体内GSH的含量、Cys含量、硫酸盐同化途径的相关酶类的酶活,结果表明,谷胱甘肽、半胱氨酸的含量,随着Pb2+浓度的增大而降低,硫酸盐同化相关酶类的活性有所变化但是却与Cd2+的情况相反,说明Pb2+胁迫菌体情况下硫酸盐同化对抗性的贡献可能不明显,或是与Cd2+相反。②浸矿微生物重金属抗性基因的差异表达分析通过生物信息学的分析,发现了十个可能与重金属抗性相关的基因。利用Real-time PCR技术,对Cd2+胁迫下重金属抗性基因的差异表达情况进行了考查,结果表明,在不同浓度的Cd2+刺激下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量,均呈上调趋势,相对对照组大约上调了1-8倍,且随着Cd2+浓度的增加,上调倍数也随之增加。预测Cd2+的转运模型为Czc操纵子是由H+离子梯度驱动,由位于内膜上的QcA1,2A将重金属Cd(Ⅱ)泵出到细胞质,然后由CzcB1A,f(?)将重金属穿梭至外膜,并预防重金属进入周质,CzcB1A,f也可以提供其他重金属的特异性。CzcC1A,f则完成将重金属排出到外部环境的全过程。CmtR是重金属的转录调控因子,位于胞内,作为识别的信号。CadB1A,f和CadB2A,f是转运体,帮助CzcB1A,f将重金属运出体外。在Zn2+胁迫下,重金属抗性基因的表达差异情况结果表明,在不同浓度的Zn2+胁迫下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量也是呈上调趋势,大约是对照组的1.2到630倍,且随着Zn2+浓度的增加,上调倍数也随之增加,说明这些基因的表达情况,大部分与Cd2+胁迫下情况相似。但是CzcABCAf重金属排出系统的基因(AFE-0671CzcA1A,f、AFE-1144CzcA2A,f、AFE-1142CzcC1A,f和AFE-1143CzcB1A,f)变化不大,说明对于Zn2+的抗性的贡献可能不是很大,而基因AFE-2437CadB1A,f、AFE-2438CadB2A,f、AFE-2920CadB3A,f这三个转运蛋白,在Zn2+胁迫下,却是随着重金属浓度的增大而逐渐增加的,说明转运蛋白对于锌离子的抗性贡献较大。在Pb2+胁迫下,重金属抗性基因的表达差异情况研究发现,在不同浓度的Pb2+胁迫下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量均呈下调趋势,且随着Pb2+浓度的增加,并没有明显的调控趋势,说明在Pb2+胁迫下大多数抗性基因,没有表现出明显的调控或者为负调控。③重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差异分析通过生物信息学分析,找寻到硫酸盐同化的相关的关键基因,对其进行体外重组表达和酶活分析,确定了硫酸盐同化的基本代谢路径。被运输到体内的硫酸盐被cysDN编码的ATP硫酸化酶激活为APS(adenosine-5’-phosphosulfate),随后被APS还原酶还原为亚硫酸盐,亚硫酸盐又被cysJI编码的亚硫酸盐还原酶还原为硫化物,最后硫化物与O-乙酰丝氨酸由cysM编码的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。通过对重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差异分析,结果表明在Cd2+胁迫下,硫酸盐同化的相关基因的表达,表现为上调趋势,大约是对照组的1到3倍,随着离子浓度的增大,上调倍数越大。但是锌离子胁迫下只有少数几个基因表达上调,而铅离子胁迫下,则没有明显的上调。表明硫酸盐同化基因对于镉离子的抗性的较大,而对其他两种金属离子则较小④浸矿微生物重金属抗性关键基因的过表达分析研究发现,CysE和CmtR基因是转录调控作用的关键的抗性基因,为了进一步的了解其功能,采用过表达分析的方法考查了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果表明：在不同浓度Cd2+的胁迫下,BL21导入重金属抗性基因后,相对于对照组,菌体的生物量,没有明显的变化,但是其体内Cys和GSH的含量却有所增加,同时体内的重金属含量也是有所增加,说明导入抗性基因后其重金属的抗性明显增强；不同浓度Zn2+的胁迫下,BL21导入重金属抗性基因后,其相应的结果与Cd2+相似,说明导入抗性基因后其重金属抗性增强；不同浓度Pb2+的作用下,BL21导入重金属抗性基因后,无论是菌体的生物量、Cys和GSH的含量,还是其体内的重金属含量,相对于对照组均是降低的,说明导入抗性基因后其重金属抗性没有明显的改善或者是下降的。⑤重金属浸出及其种群优势度的分析16S rDNA-RFLP分析结果表明,所选取的三个AMD(酸性矿坑水)采样点中,均含有Acidithiobacillus菌属的微生物,每个样点均有部分菌株独立于已知菌株存在,独立存在的菌株数目占所考查菌株数目的一半左右；并且三个样点之间浸矿微生物的种类及数量相似度较大,说明这三个考查点其中的地球化学环境相似。用AMD对四种不同组成的矿石浸出后,发现其对Ag、Pb及Cu有一定的浸出能力,而对As和Pb几乎没有浸出效果。微生物群落分析得出：H71和F11群落结构差异较大,而J72和S71几乎一样。从系统发育分析可知,所考查的序列可分为两大分支：Acidithiobacillus菌属和相对独立的菌属,不同矿石样品处理后均存在这两支,且发育距离较近。