TFPR1是本课题组研发的已获国家专利授权的新型佐剂,是基于竹叶青蛇毒非毒素蛋白Triflin N端的致病相关蛋白1结构域设计而成。前期研究表明TFPR1具有很好的免疫调节活性,与抗原简单混合即可增强其免疫原性,诱导Th1偏倚的Th1/Th2型体液免疫和细胞免疫应答。但是TFPR1发挥佐剂活性的功能域和能否通过树突状细胞发挥佐剂功能均不清楚,以及不知道它用作复合佐剂的主要组份是否有效,本课题针对这三个问题开展研究。目的研究树突状细胞在TFPR1发挥佐剂功能中的作用以及TFPR1发挥佐剂活性的重要结构域,并探索TFPR1作为主要组分的复合佐剂的可行性和有效性。方法(1)树突状细胞在TFPR1发挥佐剂功能中的作用研究以小鼠骨髓来源的树突状细胞为研究对象,加入TFPR1共孵育24 h,并以LPS(脂多糖)作为阳性对照、PBS作为阴性对照,分别从形态学、肌动蛋白的分布变化以及细胞表面标志三个方面分析树突状细胞的成熟情况,并ELISA检测TFPR1处理的树突状细胞分泌的细胞因子水平变化。(2)TFPR1活性功能区的研究利用生物信息学预测TFPR1的B细胞表位,结合TFPR1的二级结构和关键结构域,筛选出B细胞优势表位;在保留TFPR1关键结构域的基础上去除B细胞优势表位,设计TFPR1活性功能区,经原核构建与表达获得重组蛋白,并通过模式抗原OVA(卵白蛋白)评价其体内佐剂功能,以及通过检测其激活树突状细胞产生细胞因子的能力反映其体内佐剂活性。(3)以TFPR1为基础的复合佐剂TF-Al的佐剂活性及特征研究以OVA和HBs Ag(重组乙肝表面抗原)为模式抗原经肌肉注射免疫小鼠,免疫三次、间隔三周,于末次免疫后14天ELISA检测小鼠血清中特异性抗体Ig G及其亚类Ig G1、Ig G2a的水平,分别比较以TFPR1为基础的复合佐剂TF-Al(TFPR1和铝佐剂的合称缩写)诱导的免疫应答与TFPR1、铝佐剂单独诱导的免疫应答之间的异同,分析复合佐剂TF-Al的佐剂活性及其特征。结果(1)TFPR1可以促进树突状细胞成熟并激活其产生细胞因子树突状细胞在形态学、肌动蛋白以及细胞表面标志三个方面的变化情况表明TFPR1可以促进树突状细胞发育成熟;同时ELISA检测发现TFPR1处理的树突状细胞比阴性对照组细胞产生更高水平的IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α等细胞因子,表明TFPR1可能通过促进树突状细胞成熟并激活其产生细胞因子发挥佐剂功能。(2)包含α1螺旋或β4折叠以及二者同时缺失的三个片段具有不同的免疫活性动物实验表明TFPR1在缺失N端的α1螺旋和C端的β4折叠时(即TFPR-T),不能增强OVA的免疫原性,进一步检测发现它不能有效激活树突状细胞产生细胞因子,表明TFPR1促进树突状细胞产生细胞因子的能力与其体内佐剂功能密切相关。当在TFPR-T的N端补上α1螺旋时(TFPR-hd)或者在C端补上β4折叠时(TFPR-ta),均可以有效激活树突状细胞产生细胞因子,且TFPR-ta的免疫原性低于TFPR-hd的免疫原性。(3)复合佐剂TF-Al可以增强蛋白类抗原的免疫原性,诱导Th1偏倚的免疫应答以蛋白类抗原(OVA和HBs Ag)评价复合佐剂TF-Al的佐剂活性,结果发现TF-Al诱导小鼠体内产生的特异性抗体Ig G及其亚类Ig G1的效价均显著高于TFPR1、铝佐剂单独诱导的抗体效价;而且TF-Al可以诱导产生较高水平的Th1型应答相关抗体Ig G2a,其水平显著高于铝佐剂单独诱导的水平,也稍微高于TFPR1单独诱导的水平,表明复合佐剂TF-Al的佐剂活性优于TFPR1和铝佐剂。结论TFPR1可以促进树突状细胞发育成熟,并激活树突状细胞分泌细胞因子,发挥免疫调节和增强作用;保持TFPR1完整的空间构象是发挥佐剂活性所必需的,N端的α1螺旋和C端的β4折叠不能同时缺失;TFPR1可以作为复合佐剂的重要成分发挥作用。