重楼皂苷提取自百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎,能有效抑制肿瘤细胞的增殖。已有的研究发现重楼皂苷抗肿瘤作用主要依赖线粒体途径的细胞凋亡,最近随着研究的深入,发现重楼皂苷可以诱导多种肿瘤细胞自噬。本实验以SW480细胞为研究模型,探讨重楼皂苷Ⅰ（polyphyllin-I,PPI）诱导SW480结肠癌细胞凋亡中自噬的作用及相关通路。以了解重楼皂苷Ⅰ诱导结肠癌细胞自噬的调节机制,从而为重楼皂苷Ⅰ治疗结肠癌的研究提供充分可靠的理论支持。主要研究结果如下:1、重楼皂苷Ⅰ能抑制SW480细胞增殖活性。实验采用含10%胎牛血清的L-15培养基培养SW480细胞,待细胞生长至培养皿的80%左右时,给予不同浓度的重楼皂苷Ⅰ（0、1、2、3、4、5μmol/L）处理12h、24h,采用MTT法检测细胞存活率的变化,DAPI核荧光染色,倒置显微镜观察不同浓度重楼皂苷Ⅰ处理后细胞的核形态和数量的变化。结果表明,重楼皂苷Ⅰ作用于人结肠癌SW480细胞后能对细胞增殖有明显的抑制作用,且呈时间-浓度依赖性。同时显微镜下观察发现重楼皂苷Ⅰ刺激后的细胞核出现明显的形态改变,确定重楼皂苷Ⅰ能够有效地诱导SW480细胞凋亡。2、重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞自噬的作用。对于重楼皂苷Ⅰ是否能诱导结肠癌SW480细胞发生自噬,其自噬所发挥的作用及通路仍未研究清楚。实验采用Western blot方法和吖啶橙（AO）染色法分析重楼皂苷Ⅰ对自噬标志蛋白LC3-II/I表达量及细胞内酸性自噬泡的影响。结果表明,重楼皂苷Ⅰ确实能诱导SW480细胞内橙红色酸性自噬泡累积,诱导自噬标志蛋白LC3-II/I表达量显著升高,诱导SW480细胞发生自噬。进一步验证重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞自噬的作用,给予自噬抑制剂CQ预处理细胞1h,测定不同浓度重楼皂苷Ⅰ对细胞增殖活性、核形态变化及自噬标志蛋白LC3-II/-I表达量的影响。结果表明,重楼皂苷Ⅰ在SW480细胞中诱导的自噬随着药物浓度和时间的改变发挥着不同的作用,当12h时,1-4μmol/L的重楼皂苷Ⅰ与CQ联合作用较重楼皂苷Ⅰ单独作用组细胞活力显著降低,说明此时重楼皂苷Ⅰ诱导的SW480细胞自噬是一种保护性自噬,使用自噬抑制剂CQ阻断自噬作用后,重楼皂苷Ⅰ诱导的细胞死亡显著增加,抗肿瘤的作用增强。然而当作用24h时（包括作用12h时5μmol/L的PPI）,预添加组较重楼皂苷Ⅰ单独作用组细胞活力显著升高,凋亡核形态细胞数明显减少,说明此时重楼皂苷Ⅰ诱导的SW480细胞自噬起到了诱导细胞凋亡的作用,阻断自噬后重楼皂苷Ⅰ抗肿瘤作用被削弱。3、重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞ROS途径和AKT/mTOR途径的自噬。进一步探讨重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞自噬作用机制,实验采用荧光探针DCFH-DA绑定检测给予IC₅₀浓度重楼皂苷Ⅰ及预添加NAC处理1h后细胞内ROS的变化（12h、24h）,采用Western blot方法分析重楼皂苷Ⅰ自噬相关信号通路蛋白p-mTOR、m-TOR、p53、p-AKT、AKT和p-JNK、JNK表达水平的影响,同时检测药物作用12h、24h时预添加NAC、SP600125处理组细胞LC3-II/I表达水平、细胞核形态及细胞增殖活性的变化。结果表明,重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞内ROS升高,与对照组相比,IC₅₀浓度的PPI在12h和24h分别诱导细胞内ROS升高42%和81%,差异极显著（P<0.01）,添加NAC组LC3-II/-I蛋白水平降低;作用12h时,预添加NAC组较单独加药组细胞存活率无显著性变化;而作用24h时,预添加NAC组细胞存活率极显著升高（P<0.01）,与DAPI染色结果相一致。说明重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞发生ROS途径的细胞自噬,诱导细胞凋亡。重楼皂苷Ⅰ诱导自噬相关通路蛋白p-AKT、p-mTOR表达量显著下降,p-JNK表达量显著升高,m-TOR、AKT、p53和JNK表达量无明显变化。添加SP600125的JNK抑制剂联合作用组较单独加药组LC3-II/-I蛋白水平无显著性变化;作用12h及24h时,MTT与DAPI染色结果表明JNK抑制剂联合作用组较PPI单独加药组细胞存活率显著升高（P<0.05）。说明重楼皂苷Ⅰ通过AKT/mTOR途径和ROS途径的诱导细胞自噬。综上,本实验的研究结果显示,重楼皂苷Ⅰ对SW480细胞有较强的生长抑制,并首次发现重楼皂苷Ⅰ能诱导SW480细胞发生自噬,其所诱导的自噬在不同作用浓度和时间发挥了不同的作用,初步探讨了重楼皂苷Ⅰ诱导SW480细胞自噬的调节机制。