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猪繁殖与呼吸障碍综合征俗称蓝耳病,是目前认为猪最重要的传染病之一,每年给养猪业带来的巨大的经济损失。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,典型的临床症状主要表现为母猪的繁殖障碍,感染猪体温升高和呼吸道疾病。高致病性PRRSV毒株的感染可以引起更严重的临床体征,肺部病变和异常宿主免疫应答。根据基因组同源性差异,PRRSV已划分为PRRSV1和PRRSV2两个不同的种。该病的诊断主要包括病原学诊断和血清学诊断。本研究通过大肠杆菌系统表达了 PRRSV的糖蛋白GP3,GP4和GP5,通过免疫动物获得了针对GP3和GP5的多克隆抗体以及针对GP4的单克隆抗体,为PRRSV的结构蛋白功能的研究,建立检测PRRSV抗原方法奠定了基础。同时本实验尝试以多肽为包被抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,为PRRS的快速诊断和我国养猪业健康发展提供条件。1.PRRSV糖蛋白单克隆抗体的制备本研究首先合成了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒RD2007株GP3,GP4和GP5的特异性引物,利用PCR技术从病毒RNA中扩增相关基因。成功构建了原核表达载体pET32a-PRRSV-GP3,pET32a-PRRSV-GP4 和 pET32a-PRRSV-GP5,将其转化入 BL21 感受态细胞,经IPTG诱导表达,对表达的菌体进行超声波破碎,取离心后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析,结果成功表达出大小分别约为40KD,30KD和30KD的目的蛋白。Western-blot 结果显示三个重组蛋白均与鼠抗 His 单抗反应,GP3 和 GP5 蛋白能与猪抗 PRRSV 多抗血清反应,表明其反应原性较好。纯化后的pET32a-PRRSV-GP3,pET32a-PRRSV-GP4和pET32a-PRRSV-GP5分别与佐剂乳化后免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,结果三种不同蛋白均能诱导小鼠产生特异抗体;对免疫效果最好的GP4免疫小鼠进行加强免疫,三天后取脾脏与骨髓瘤细胞进行融合,用感染PRRSV病毒的Marc145细胞板固定后作为检测抗原,对融合成功的杂交瘤细胞进行IFA筛选。阳性杂交瘤进行亚克隆,最后获得了针对PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体,命名为PRRSV-GP4-1F11。2.PRRSV多肽ELISA抗体检测方法的建立以合成的多肽为包被抗原,建立PRRSV抗体检测的间接ELISA方法。对该方法进行优化,确定最佳多肽包被浓度,最佳血清稀释度,最佳封闭液和封闭时间,最佳一抗和二抗反应时间,最佳显色时间。通过优化条件后验证ELISA检测方法的特异性、可重复性。实验结果显示,该方法与PRRSV阳性血清反应,与其他常见猪病病毒(猪瘟病毒CSFV、猪伪狂犬病毒PRV、猪流行性腹泻病毒PEDV等)的多抗血清不反应,显示该方法特异性强。此外,此方法的批间和批内变异系数均小于10%,说明其具有良好的可重复性。用建立的间接ELISA检测方法分别检测133份送检猪血清,结果显示GP3/4-ELISA 阳性检出率为78.6%,GP5-ELISA 阳性检出率为81.6%。这些结果说明,不同包被蛋白在检测PRRSV抗体时有一定差异,对疫苗免疫效果和感染评价有一定指导意义。