异戊醇是多种化学品合成的前体物质,吸湿性较低,能量密度较高,各种理化性质与汽油非常接近,可用作生物燃料。与生物乙醇相比,异戊醇的辛烷值较高,用作交通运输燃料时抗爆性能较好。酿酒酵母通过自身的氨基酸代谢途径可以生成少量异戊醇。本工作选用酿酒酵母作为宿主菌,利用生物发酵的方法生产异戊醇,并对菌株进行基因改造,提高异戊醇的产量。本研究从优化酿酒酵母异戊醇合成途径和提高酵母异戊醇等醇类耐受性两方面提高异戊醇产量。优化酿酒酵母异戊醇合成途径的研究主要包括以下三方面内容。首先,过表达异戊醇合成途径关键基因ADH7、LEU1、LEU9和LEU4,所构建工程菌W303-1AC235-ADH7-LEU1-LEU9在YPD培养基发酵时,异戊醇产量为0.35 g/L,比野生型对照菌株异戊醇产量提高了40%;其次,通过敲除编码醇脱氢酶的ADH1基因,删除竞争性旁路代谢途径,所构建工程菌株W303-1AC235-ADH7-LEU1-LEU9-adh1Δ在CM选择性培养基发酵时,异戊醇产量为0.24 g/L,比工程菌W303-1AC235-ADH7-LEU1-LEU9异戊醇产量略高。最后,通过过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的ZWF1基因,以及与丙酮酸脱氢酶相关的PDH1、PDB1基因为异戊醇的合成提供还原力,所构建工程菌株W303-1AC235-ADH7-LEU1-LEU9-LEU4-ZWF1在YPD培养基发酵时异戊醇产量为0.39 g/L。以上结果表明,过表达缬氨酸和亮氨酸代谢途径基因可以提高酿酒酵母异戊醇产量;敲除ADH1基因对异戊醇产量影响不大;过表达ZWF1基因对提高异戊醇的产量有积极作用。提高酵母异戊醇等醇类耐受性的研究包括三个方面内容。首先,研究了SPT15及其突变基因对酿酒酵母细胞异戊醇耐受性的影响,菌株spt15-p-65in G在有异戊醇抗性压力的生长情况略优于其它对照菌株。其次,研究了野生型SPT15及5个突变型spt15基因对酿酒酵母细胞乙醇耐受性的影响。结果表明,工程菌株spt15-p-65in G对乙醇的耐受性较高,并且该菌株的乙醇产量比对照菌株提高了21%。最后,研究了SPT15及其突变基因对酿酒酵母细胞异丁醇耐受性的影响,菌株spt15-p-65in G的异丁醇耐受性稍高。发酵结果表明,过表达野生型SPT15基因对酿酒酵母异丁醇产量有显著提高,而过表达突变基因spt15-65对异丁醇产量没有明显提高。以上结果表明,菌株spt15-p-65in G对异戊醇、乙醇、异丁醇的耐受性要高于对照菌株以及其他基因突变型菌株。也就是说,质粒YCplac22-spt15-p-65inG上所包含的基因spt15-65突变位点对提高酿酒酵母对异戊醇、乙醇和异丁醇的耐受性有积极作用。本研究利用酿酒酵母作为宿主菌合成异戊醇,为微生物生产异戊醇提供了新的思路。另外,本工作还构建了用于CRISPR/Cas9基因编辑的gRNA质粒YEplac195-f1ori-ARO10gRNA-ADH7gRNA-OAC1gRNA,为后续构建高产异戊醇的酿酒酵母菌株提供了功能元件。