研究背景及意义:随着人类全基因组测序的完成,遗传病的致病基因的发现及研究进展,更新了人们对许多疾病致病机制的认识。离子通道病的遗传学研究是当今国内外心血管疾病的前沿与热点。过去的20年,随着心脏离子通道病的基础-临床转化研究取得的重要进展,已极大改变了临床医生对这类疾病诊断和治疗的困境。如发现了一些编码心脏离子通道及相关蛋白的基因突变可导致多种遗传性心律失常,包括长QT综合征(LQTS)、短QT综合征(SQTS)、Brugada综合征等,并解析了其相关分子机制。尤其值得关注的是,理想的基因检测可以判别患者的危险分层,尤其是明确家族成员中携带基因突变的高风险“沉默”患者。但需要认识到,基因测试可以揭示患者基因组序列变化,但判别突变是否为患者疾病的临床病因依旧是一个极大挑战。遗传性LQTS是最常见亦是最早发现的心脏离子通道病,由遗传基因突变而引起的一种心肌复极延迟性疾病,主要表现为QT间期延长与之继发的恶性心律失常,发作性晕厥和心原性猝死(SCD)。LQTS分子遗传机制的研究取得了显著进展,根据其致病基因发现的先后顺序,分为13种基因型。自Keating等对LQTS做出开创性的发现以来,KCNQ1,KCNH2,SCN5A基因的特异性突变被确定为LQTS基因缺陷的基础。除遗传因素外,某些药物、电解质紊乱、器质性心脏病、体温异常、代谢紊乱及某些神经系统疾病等因素均可通过素影响心脏离子通道功能,而影响心肌细胞的复极化过程而导致QTc延长,以及尖端扭转型室性心动过速(Td P)和室颤(VF),甚至SCD,称之为获得性LQTS。此外,年龄、性别因素亦具有一定的影响作用。获得性LQTS因恶性心律失常所致的猝死是院内SCD的重要因素之一,应引起临床医师的高度警惕。LQTS致病基因的发现是心血管疾病遗传研究领域一个里程碑的研究成果,不同基因型LQTS患者的临床表现具有显著差异,猝死风险不一。在某些情况下,突变“热点(hot spots)”可增加心律失常的风险。尽管这些研究结果可用于引导基因治疗但存在一定困难,由于携带同一致病突变的家系成员的外显率不一致,临床表型可存在显著差异,这可能是由于基因修饰引起了表型的改变。许多基因可影响心肌细胞复极化过程,影响相同LQTS致病基因携带者的临床表型。LQTS致病基因的发现是了解心肌细胞正常复极化过程分子机制的至关重要的第一步,可辅助指导LQTS新疗法的筛选,亦有助于进一步了解心律失常致病机制,为患者最有效的治疗及预防措施提供理论依据。越来越多的研究显示,除基因突变,一些常见的单核苷酸多态性(SNPs)亦可直接或间接引起心肌细胞离子通道功能发生变化。这些SNPs单独表达或许并不影响离子通道的表达、跨膜转运和电生理特性,可能通过基因内互补作用调节基因突变对离子通道的作用,增加突变携带者的患病风险及加重其临床表型。在获得性QT间期延长因素作用下,SNPs可进一步加重离子通道功能障碍,类似“多次打击学说”,导致复极储备能力显著下降而引起QT间期延长。故SNPs可显著增加遗传性和获得性LQTS的遗传易感性。SNPs存在显著的种族和地区差异,因此,了解国人LQTS及易感人群SNPs有助于指导临床风险分层和个体化治疗,预防高危患者SCD。目的:我国已发现包括KCNQ1、KCNH2、SCN5A、KCNE1、KCNJ5在内的5个LQTS致病基因共43个基因突变,为了进一步完善国人LQTS致病基因突变数据库,为国人LQTS基因筛查奠定理论基础,及解析国人LQTs综合征致病基因突变的特征性,本课题拟以临床体表心电图QT间期延长的患者及其家系成员为研究对象,应用遗传检测技术寻找基因突变,探讨其电生理致病机制、基因型与临床特征的关系及其与致恶性心律失常的关系,揭示遗传性LQTS的遗传致病机制。材料方法:收集临床资料及实验标本:收集体表心电图QT间期延长患者临床资料,排外温度、电解质异常及某些药物因素等所致复极化异常引起的QT间期延长。采集患者及其家系成员外周血标本。随访:对本研究收集的LQTS患者进行追踪随访,了解其治疗情况和恶性心血管事件。基因检测:对所采集的外周血,应用酚-氯仿抽提法提取其全基因组DNA,设计遗传性LQTS13个已知致病基因及候选基因KCNA5(KV1.5)、KCND3(KV4.3)、KCNE2(Mi RP1)、KCNJ12(Kir2.2)、KCNJ11(Kir6.2)、KCNJ8(Kir6.1)、KCNJ4(Kir2.3)及KCNJ3(Kir3.1)的外显子引物,应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增候选致病基因的外显子序列,PCR扩增所得产物进行纯化,纯化产物直接测序。将测序结果与NCBI Gen Bank中BLAST程序进行同源性比较,对所发现的基因变异体与200例同种族背景正常人群相同基因测序结果进行比对,以明确所发现变异为基因突变或多态性,并分析突变类型及有无氨基酸改变。定点诱变及细胞转染:根据突变位点的碱基序列设计诱变引物,应用重组PCR技术进行定点突变诱导,PCR扩增产物进行基因测序以明确定点诱变是否成功及正确。将携带野生型基因序列、定点突变的基因序列的质粒分别导入pc DNA3.1+细胞表达载体,对突变质粒进行测序验证,确定克隆是否成功,从而筛选出阳性克隆。对SCN5A基因突变,将脂质体与野生型质粒或突变SCN5A质粒转染入人胚肾293细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293),简称HEK 293细胞,重组基因进行稳定表达。应用同样的方法,将野生型及突变型KCNQ1质粒分别转染入经SV40病毒基因转化的非洲绿猴肾成纤维细胞系(African green monkey kidney derived cell line),简称COS-7细胞,重组基因进行稳定表达。膜片钳技术功能分析:已转染了野生型质粒或突变质粒的HEK293细胞及COS-7细胞于37℃培养箱中分别培养24、48小时。应用膜片钳电生理技术,在全细胞模式下,分别记录野生型、突变型离子通道的电流变化。分析比较野生型、突变型离子通道的电流特征及活性动力学特征,对实验数据进行统计学分析比较。研究结果:1、临床资料共收集到符合条件的9例LQTS先证者,男性3人,女性6人,年龄11~87岁,其中3个LQTS家系,共20人。通过临床资料对比发现,(1)基因突变先证者发病年龄明显小于无基因突变患者(31.8±8.82 VS 49.11±8.65,P<0.01),差异有显著统计学意义;(2)基因突变先证者与无基因突变患者的平均PR间期(156ms±18.33ms VS 170ms±19.15ms)、平均QRS间期(92ms±8ms VS 115ms±23.63ms)、平均Tp Te时限(176ms±19.39ms VS 200ms±31.62ms,P>0.05)差异无统计学意义。(3)基因突变先证者的平均QTc(578.92ms±38.18ms VS541.98ms±42.38ms)呈现较长趋势。2、遗传基因检测在9个LQTS先证者中,发现5位患者携带5个不同基因突变,3个为SCN5A基因突变,分别为V411M、S705F和R1846H;2个KCNQ1基因突变分别为R380S和W305L。其中,SCN5A基因R1846H突变和KCNQ1基因W305L突变为国际首次报道。9例临床诊断LQTS患者,基因突变率高达55.56%(2个LQT1,3个LQT3)。基因突变先证者家系成员的突变携带率为41.18%。共发现7个基因的26个SNPs,包括(1)9个SCN5A基因SNPs:A29A、704+21C<T、P336P、1141-3C>A、1339-24G>A、H558R、P1089L、R1192Q和D1818D;(2)9个KCNJ12基因SNPs:S15L、R39Q、R40H、R81R、I100V、R118V、P156L、Q192H和G216G;(3)3个KCNQ1基因SNPs:S546S、1591+36A>G和1686+114T>G;(4)1个KCNJ2基因SNP:L382L;(5)1个KCND3基因SNP:1107+15C>A;(6)1个KCNA5基因SNP:R550R;(7)2个KCNJ11基因SNPs:A190A和V337I。KCNJ12-R118V和KCNA5-R550R为首次报道。除SCN5A-D1818D,9位LQTS先证者SNPs发生率高于本研究同地区、种族健康人群对照组。无突变先证者SCN5A-P336P发生概显著高于CSAgilent报道。无突变先证者KCNQ1-S546S发生率显著高于本研究对照组、亚洲和欧洲人群概率。本研究LQTS先证者发生SCN5A-H558R、SCN5A-1089L、SCN5A-R1192Q均高于正常对照组,NCBI-SNP-Geneview未见相关报道。3、细胞电生理检测结果SCN5A基因突变对Nav1.5通道的作用:(1)电流密度-电压关系显示,SCN5A基因V411M、S705F和R1846H突变均使Nav1.5通道发生功能增强性改变。与野生型相比,V411M、S705F和R1846H突变电流峰值分别增加1.28倍、46%和58.09%,差异有统计学意义;(2)稳态激活曲线(SSA)结果显示,测试脉冲在-50mv时,V411M突变Nav1.5通道激活百分比显著高于野生型(85.00%±7.43%VS 41.50%±2.60%,P<0.01),差异有统计学意义,S705F和R1846H突变不改变Nav1.5通道的SSA曲线;(3)稳态失活曲线(SSI)显示,V411M和R1846H突变不改变Nav1.5通道的SSI,电压在-110m V到-70m V范围时,S705F使Nav1.5通道SSI曲线左移,标准电流减少(P均<0.05),差异有统计学意义。KCNQ1基因突变对Kv7.1通道的作用:R380S突变致Kv7.1通道功能丧失。与野生型相比,从-50 mv始,随测试脉冲电压增加,R380S突变Kv7.1通道电流显著降低,P<0.05,差异有统计学意义。与野生型相比,R380S突变不改变Kv7.1通道的SSA特性。讨论:LQTS是一种常见的遗传性心律失常综合征,其致病基因的发现是了解心肌细胞正常复极化过程分子机制的至关重要的第一步,不仅有助于LQTS的基因诊断,而且可指导开发新的治疗措施。不同基因型LQTS的遗传背景不同,临床表型也有很大的差异。除遗传因素外,各种可导致QT间期延长的后天因素亦是获得性LQTS危险分层的影响因素,且各种易感因素具有累加作用,危险因素越多,患病风险及SCD风险越高。获得性LQTS因恶性心律失常所致的猝死是院内SCD的重要因素之一。本研究在9例不同家系来源的先证者中发现5例先证者携带5个不同基因突变,3个SCN5A基因杂合错义突变,分别为V411M、S705F和R1846H;2个KCNQ1杂合错义基因突变,R380S与W305L。其中,SCN5A-R1846H突变与KCNQ1-W305L突变均为国际首次报道。电生理研究发现,SCN5A基因V411M、S705F和R1846H突变使Nav1.5离子通道发生不同程度的功能增强性改变,KCNQ1基因R380S突变导致Kv7.1离子通道功能显著丧失。基因突变先证者发病年龄明显小于无基因突变先证者,其平均QTc有大于无基因突变患者的趋势。不同LQTS患者遗传背景不同,临床表现亦可有很大差异。致病基因是临床表型的主要决定因素,但基因突变的位置亦可影响临床表型的严重程度。3个SCN5A基因突变(V411M、S705F和R1846H)与2个KCNQ1基因突变(R380S和W305L)先证者的ECG特征等临床表型不同。SCN5A基因不同位点突变先证者临床表型不同,且与突变对Nav1.5通道功能影响的程度有关。V411M突变位于Nav1.5钠离子通道的D I结构域的S6跨膜片段,其致通道功能增强程度显著大于S705F和R1846H,该突变先证者6发病年龄更小,QTc与Tp Te更长,且其家系成员中有4人死于SIDS。相同基因突变患者临床表型之间的差异表现在先证者6与其卵双胞胎妹妹具有完全一致的遗传背景(SCN5A-V411M),而其同卵双胞胎妹妹及3个家系成员均死于SIDS,该家系中亦有无症状携带者,提示致死性心律失常发生于部分相同遗传背景的新生儿期,这表明表型在胎儿生长发育过程中即存在着不同。SCN5A-V411M突变先证者及其家系成员中突变携带存活者可能在对抗突变作用的中占有较大优势,这导致了相同基因突变患者临床表型的差异。约50%的LQTS突变携带者可终生不发生心血管事件,这些患者如何避免突变所致的致病危害的自我保护机制目前仍不清楚。当这些“沉默”携带者在后天风险因素的作用下,如基因特异性触发因素、各种致QT间期延长的理化因素,其对抗机制受到再次破坏和攻击,至一定程度后患者将发病。SNPs可通过对基因的调节作用影响通道蛋白的特性和功能,进而影响心肌细胞复极化过程。SCN5A-P336P在无突变先证者中发生率显著高于CSAgilent报道,无突变先证者KCNQ1-S546S发生率显著高于本研究对照组、亚洲和欧洲人群率,提示这两个SNPs可能增加LQTS的易感性。SCN5A-H558R、SCN5A-1089L、SCN5A-R1192Q在所有LQTS先证者中概率均高于本研究正常对照组,既往文献报道SCN5A基因A29A、H588R、R1192Q和D1818D多态性为LQTS易感因素之一,这些SNPs亦可能增加了本研究先天性和获得性LQTS先证者的患病风险。先证者1和先证者2分别因心肌缺血/梗死、扩展性心肌病等致QT间期延长,即心脏疾病导致的获得性LQTS,SCN5A基因P336P、R1192Q多态性可能在先证者2发病过程中起了一定作用。SNPs在各种致QT间期延长因素作用下,可进一步加重离子通道功能障碍,“多次打击”可导致复极储备能力显著下降。SNPs可增加遗传性和获得性LQTS的遗传易感性。SCN5A-V411M和KCNQ1-R380S先证者均于儿童期发病。目前,仍然有20%~35%LQTS患者的发病与13个已知致病基因无关,故虽然本研究先证者3和先证者4虽未在13个已知致病基因中发现突变,但不能排除他们存在尚未被人们发现的新LQTS基因突变。对儿童、青少年和排除继发因素的成人长QT人群早期基因检测可早期明确诊断,并对其家系成员筛查突变携带者,尤其“沉默”携带者早期预警严密随访,可以在发病前的数年,甚至数十年开始行早期干预,如改变生活方式,避免加速疾病进展的环境因素,按遗传性心律失常运动管理规则选择适当运动类型而非盲目预防,从而显著提高治疗效果并改善预后,这对延长患者寿命,改善生活质量具有重要的指导意义。无症状携带者及临床症状不典型患者难以用传统方法确诊,因SCD是某些LQTS患者的首发症状,这亦提示了基因检测对于无症状携带者的重要性。目前,仍有许多遗传性LQTS患者未找到致病基因,这提示仍有新的致病基因有待研究者去探索发现。许多遗传因素致病机制尚未完全阐明,其病因学的明确需要依靠分子基因诊断和遗传分析技术的开展。基因测序筛查特异性致病突变如基因重要功能区域的高危突变位点,不仅有助于临床风险评估分层,筛选高危患者,亦有助于了解离子通道的结构、电生理性质和心律失常的致病机制。本研究发现5个新的国人LQTS基因突变,2个新的SNPs,使国人LQTS基因突变由43个增加至48个,为国人LQTS遗传数据库积累了新的资源。疑似LQTS患者及其家系成员的基因型检测不仅可以筛查致病基因和易感基因,有助于进一步深入了解遗传致病机制,揭示其遗传规律的同时,可指导探索新的防治思路和方法,为提高防治水平提供遗传理论基础和依据,同时可指导患者临床风险分层和个性化治疗,并通过体外动物或细胞模型筛查特异性药物。对筛查出的LQTS突变携带者分析后代的患病风险,提供遗传咨询,指导优生优育,减少遗传性LQTS患儿的出生,提高出生人口身体素质。结论:1、国人KCNQ1基因突变R380S和W305L导致的钾通道功能丧失及SCN5A基因突变V411M、S705F和R1846H引起的钠通道功能增强与LQTS有关。SCN5A-R1846H、KCNQ1-W305L为国际首次报道LQTS致病突变;2、遗传筛查发现国人长QT患者基因突变发生率高,9位先证者中有2个LQT1,3个LQT3。与非突变者比,突变携带者发病年龄更年轻;3、猝死高发家族为LQT3型,SCN5A基因跨膜片段突变导致更严重临床表型,遗传性LQTS临床表型与基因型、突变位点有关;4、LQTS致病基因SNPs可增加遗传性和获得性LQTS的遗传易感性;5、基因筛查识别家族成员高危猝死人群。