论文部分内容阅读
目的:研究小茴香总黄酮对手术完全去势法致青年小鼠、老年小鼠绝经后骨质疏松症模型及手术部分去势法致青年大鼠绝经后骨质疏松症模型的影响,观察小茴香总黄酮对成骨样细胞Saos-2增殖作用的影响,并讨论基于OPG/RANKL/RANK系统的小茴香总黄酮对绝经后骨质疏松症模型药效分子机制的作用及特点。方法:实验一:采用手术完全去势法致青年小鼠绝经后骨质疏松症模型,将动物分组后麻醉,除假手术组外,其余各组均手术完全摘除双侧卵巢,假手术组过程相同但不摘除卵巢。造模后给予青霉素七天,于造模第八天开始给药,连续给药8周,每周记录一次动物体重,于取材前一天收集小鼠24h内的尿液,离心后待行尿液中Ca、P、CRE的检测;末次给药2h后,采用摘眼球取血收集全血,离心后分离上清待行血清指标检测;X-射线检测动物股骨骨密度的变化;小动物骨骼强度测定仪进行生物力学（最大荷载量）检测;分离肾脏、肝脏、股骨、子宫、胸腺、脾脏并检测脏器指数的变化,HE染色法观察脏器组织的形态学变化,ALP染色法、Trap染色法观察股骨组织中成骨细胞、破骨细胞的分布情况;免疫组化法观察股骨组织中OPG/RANKL/RANK系统指标相关蛋白的含量变化。实验二:采用手术完全去势法致老年小鼠绝经后骨质疏松症模型,将动物分组后麻醉,除假手术组外,其余各组均手术完全摘除双侧卵巢,假手术组过程相同但不摘除卵巢。造模后给予青霉素七天,于造模第八天开始给药,连续给药8周,每周记录一次动物体重,末次给药2h后,采用摘眼球取血收集全血,离心后分离上清待行血清指标检测;X-射线检测动物股骨骨密度的变化;小动物骨骼强度测定仪进行生物力学（最大荷载量）检测;分离肾脏、肝脏、股骨、子宫、胸腺、脾脏并检测脏器指数的变化,HE染色法观察脏器组织的形态学变化。实验三:采用手术部分去势法致青年大鼠绝经后骨质疏松症模型,将动物分组后麻醉,除假手术组外,其余各组均手术摘除双侧部分卵巢,假手术组过程相同但不摘除卵巢。造模后给予青霉素七天,于造模第八天开始给药,连续给药8周,每周记录一次动物体重,末次给药2h后,采用摘眼球取血收集全血,离心后分离上清待行血清指标检测;X-射线检测动物股骨骨密度的变化;小动物骨骼强度测定仪进行生物力学（最大荷载量）检测;分离肾脏、肝脏、股骨、子宫、胸腺、脾脏并检测脏器指数的变化,HE染色法观察脏器组织的形态学变化。实验四:采用MTT法研究小茴香总黄酮促成骨样细胞Saos-2增殖的最佳浓度,在此基础上探究小茴香总黄酮对成骨样细胞Saos-2中OPG/RANKL/RANK系统指标及Ca2+、ALP水平的影响,研究小茴香总黄酮对成骨样细胞Saos-2细胞增殖作用及OPG/RANKL/RANK系统的影响。结果:实验一:青年小鼠完全去势可用于复制绝经后骨质疏松症模型。研究结果显示,与假手术组相比,模型组可使小鼠体重显著升高,肝脏、肾脏、股骨、子宫、胸腺、脾脏指数显著降低,股骨骨密度显著降低,胫骨生物力学（最大荷载量）显著降低。血清OPG、E2、Ca、TGF-β、IL-10、IL-18水平显著降低,R ANKL、RANK、P、AKP、IL-3、IL-7、IL-8水平显著升高,尿液中Ca水平显著降低,CRE水平显著升高,股骨组织中OPG水平显著降低,RANKL、RAN K水平显著升高,股骨组织中成骨细胞分布显著降低、破骨细胞显著升高。小鼠各脏器体积萎缩,并出现显著病变。实验结果提示手术去势法将通过影响OPG/RANKL/RANK系统干预Ca形成,导致绝经后骨质疏松症模型。与模型组相比,仙灵骨宝胶囊组、小茴香总黄酮各剂量组可改善动物体重降低趋势,改善各脏器指数,并显著提高股骨骨密度及胫骨生物力学（最大荷载量）。仙灵骨宝胶囊组、小茴香各剂量组可升高血清OPG、E2、Ca、TGF-β、IL-10、IL-18水平,降低R ANKL、RANK、P、AKP、IL-3、IL-7、IL-8水平,显著升高尿液中Ca水平,显著降低CRE水平,股骨组织中OPG水平显著升高,RANKL、RANK水平显著降低,股骨组织中成骨细胞显著升高、破骨细胞显著降低,各脏器病理变化得到改善,起到治疗绝经后骨质疏松症的效果。实验结果提示小茴香总黄酮可通过干预OPG/RANKL/RANK系统,影响雌激素分泌,干预其介导的炎症因子的表达,促进骨重建从而用于治疗绝经后骨质疏松症实验二:老年小鼠完全去势可用于复制绝经后骨质疏松症模型。研究结果显示,与假手术组相比,模型组可使小鼠体重显著升高,肝脏、肾脏、股骨、子宫、胸腺、脾脏指数显著降低,股骨骨密度、胫骨生物力学（最大荷载量）显著降低。血清OPG、E2、Ca、SOD、LEP水平显著降低,RANKL、RANK、P、ALP、B GP、IL-6、IL-13水平显著升高。老年小鼠各脏器体积萎缩,并出现显著病变。实验结果提示年龄因素结合手术去势法将通过影响OPG/RANKL/RANK系统干预Ca形成,导致绝经后骨质疏松症模型。与模型组相比,仙灵骨宝胶囊组、小茴香总黄酮各剂量组可致动物体重降低,同时升高各脏器指数,显著提高股骨骨密度、胫骨生物力学（最大荷载量）,使血清OPG、E2、Ca、SOD、LEP水平升高,RANKL、RANK、P、ALP、BGP、IL-6、IL-13水平降低,改善各脏器病理变化,起到治疗绝经后骨质疏松症的效果。实验结果提示小茴香总黄酮可通过干预OPG/RANKL/RANK系统防治绝经后骨质疏松症。实验三:青年大鼠部分去势可用于建立绝经后骨质疏松症模型。研究结果显示,与假手术组相比,模型组可使大鼠体重显著升高,肝脏、肾脏、股骨、子宫、胸腺、脾脏指数显著降低,骨密度显著降低,胫骨生物力学（最大荷载量）显著降低。血清OPG、E2、FSH、Ca、BGP、LEP、IL-4、IFN-γ水平显著降低,RA NKL、RANK、P、TNF-α、M-CSF、IL-1、TRAF6水平显著升高。大鼠各脏器体积萎缩,并出现显著病变。实验结果提示手术部分去势法将通过影响OPG/RA NKL/RANK系统干预Ca形成,导致绝经后骨质疏松症。与模型组相比,仙灵骨宝胶囊组、小茴香总黄酮各剂量组可使青年大鼠体重降低,同时升高各脏器指数,使骨密度显著升高,显著提高胫骨生物力学（最大荷载量）,血清OPG、E2、F SH、Ca、BGP、LEP、IL-4、IFN-γ水平升高,RANKL、RANK、P、TNF-α、M-CSF、IL-1、TRAF6水平降低,改善各脏器病理变化,起到治疗绝经后骨质疏松症的效果。实验结果提示小茴香总黄酮可通过干预OPG/RANKL/RANK系统防治绝经后骨质疏松症。实验四:通过MTT法研究可知小茴香总黄酮可显著提高成骨细胞Saos-2增殖速度;小茴香总黄酮可显著提高成骨细胞Saos-2中OPG、Ca水平,同时显著降低成骨细胞Saos-2中RANKL、RANK水平。成骨细胞增殖及细胞生化指标测定结果提示小茴香总黄酮可通过OPG/RANKL/RANK系统改善细胞Ca含量,对骨重建过程有重要影响。结论:小茴香总黄酮可改善手术法完全去势致青年小鼠、老年小鼠绝经后骨质疏松症动物模型以及手术部分去势法致青年大鼠绝经后骨质疏松症动物模型的体重、骨密度、生物力学（最大荷载量）,改善因雌激素水平变化引起的动物模型中OPG/RANKL/RANK系统相关血清指标、尿液指标及脏器组织病理变化,改善股骨组织中成骨细胞、破骨细胞的分布,小茴香总黄酮可促进成骨样细胞Saos-2增殖并改善相关指标水平,可有效缓解绝经后骨质疏松症。