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目的:人的细胞中大部分的基因都存在可变剪接调控,从而介导细胞的生理或病理的过程,包括肺癌细胞的转移。其中Mena基因的可变剪接形成的截短型异构体Mena INV作为癌细胞肌动蛋白的重要调控者,于肿瘤转移过程中发挥着相当重要的作用,但是调控Mena基因的可变剪接的具体机制并没有深入的报道。我们通过研究剪接因子PTBP1肺癌细胞转移与侵袭的促进作用,讨论Mena异构体受PTBP1调节并参与调控肺癌细胞转移进程,旨在探索PTBP1通过Mena可变剪接调控肺癌细胞转移的新机制。方法:1.TCGA数据库分析肺腺癌组织与正常肺部组织中PTBP1的表达并根据生存曲线判断PTBP1的高表达与肺腺癌的不良预后的相关性。q PCR和Western blot检测PTBP1在高转移肺腺癌细胞95-D与非转移肺癌细胞A549的表达水平差异,RT-PCR检测Mena两种异构体Mena11a和Mena INV在上述两种细胞中比例的不同。2.使用TGFβ诱导A549细胞EMT,检测PTBP1和EMT标志蛋白如E-cadherin、Ncadherin和Vimentin表达的变化,并检测Mena11a和Mena INV的比例变化。3.逆转录病毒过表达或敲降PTBP1,划痕实验和Transwell实验分析PTBP1过表达或敲降后肺癌细胞转移与侵袭能力的改变,RT-PCR检测Mena的两种异构体比例的改变。4.构建Mena的minigene载体和突变的minigene载体,RT-PCR检测Mena在minigene水平上的比例变化,进一步验证PTBP1调控Mena可变剪接的分子机制。5.根据PTBP1结合序列的特征,通过Human Splicing Finder、RBP map和RBPDB网站或数据库,预测PTBP1在Mena的前体m RNA上的结合序列,利用RNA-pulldown技术验证PTBP1的结合序列。6.构建Mena INV过表达载体和Mena异构体的敲降载体,划痕实验和Transwell实验检测PTBP1与Mena两种因子分别变化后肺癌细胞的转移与侵袭能力,鬼笔环肽对细胞进行荧光染色,激光共聚焦系统观察PTBP1与Mena两种因子表达水平变化后肺癌细胞丝状伪足数量的变化,判断PTBP1蛋白与Mena异构体之间调控细胞转移的相互关系。结果:1.PTBP1在肺腺癌组织中的表达水平明显比正常的组织高(p<0.01),PTBP1表达水平较低的肺腺癌患者的生存率明显高于PTBP1表达水平较高的肺腺癌患者(p<0.01),说明PTBP1在肺腺癌组织中的过表达与不良预后相关;PTBP1在95-D细胞中的表达水平高于A549细胞;95-D细胞中Mena INV的比例是A549细胞中的3.38倍。2.当使用TGFβ诱导A549细胞后,浓度为5 ng/m L、10 ng/m L和20 ng/m L均能使A549细胞的转移与侵袭能力显著提高,且PTBP1的水平随着TGFβ浓度的增加而升高,但是PTBP1在10 ng/m L和20 ng/m L之间变化无显著性差异;TGFβ诱导A549细胞EMT过程中,Mena INV的比例随着诱导天数的延长而升高。3.过表达PTBP1后,N-cadherin和Vimentin的表达水平上升,E-cadherin水平下降,细胞的转移与侵袭能力均显著性提高,RT-PCR检测发现,A549细胞中过表达PTBP1后,Mena INV的比例为过表达前的1.27倍;在95-D细胞中敲降PTBP1后,N-cadherin和Vimentin的表达水平下降,E-cadherin水平升高,细胞的转移与侵袭能力均显著性下降,RT-PCR检测发现Mena INV的比例明显降低了37%。4.A549细胞中过表达PTBP1后minigene水平上的Mena INV比例显著升高了47%,敲降PTBP1后minigene水平上的Mena INV比例降低了13%。将预测的PTBP1靶位点突变为阴性序列之后结果显示Mena INV的比例随着PTBP1的过表达或敲降并不改变,初步说明了PTBP1可以调节Mena的可变剪接并进一步调控肺癌细胞的转移与侵袭。5.RNA-pulldown实验结果发现PTBP1可以与Mena前体m RNA上11a号外显子上下游的两段多聚嘧啶序列结合。6.在PTBP1过表达后敲降Mena,细胞丝状伪足数目较敲降Mena前明显减少,细胞的转移能力也显著降低,特异性敲降Mena11a时则无显著变化;在敲降PTBP1后过表达Mena INV,细胞丝状伪足数目明显增多,细胞转移能力增强。结论:1.PTBP1的表达与肺癌细胞转移以及EMT有关;PTBP1的过表达促进肺癌细胞转移,敲降PTBP1抑制肺癌细胞转移。2.PTBP1通过结合Mena前体m RNA中的多聚嘧啶序列(TTTTCCCCTT和TTTTTTTTTCTTT)结合,调控外显子11a发生可变剪接,可变剪接形式为外显子跳跃。3.Mena INV的过表达能够逆转PTBP1敲低的影响,导致丝状伪足形成增多和促进肺癌细胞转移与侵袭。总体而言,本研究提出了PTBP1增强Mena前体m RNA中外显子11a跳跃以促进肺癌细胞转移的机制。