背根神经节P2受体介导HIVgp120加抗逆转录病毒治疗相关神经病理痛与药物作用研究

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第1章引言人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染与高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy,HAART)常致使患者周围神经病理痛,研究表明,病毒包膜糖蛋白gp120与抗逆转录病毒药物扎西他滨(Zalcitabine,2′,3′-dideoxycytidine,dd C)是其重要致病因素。外周神经损伤导致三磷酸腺苷(ATP)释放增加,ATP作用于背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)神经元或卫星胶质细胞(Satellite glial cells,SGCs)中嘌呤受体,诱使SGCs与神经元之间出现病理性相互作用,由此引起DRG神经元异常兴奋并在周围神经病理痛的形成与维持中产生重要作用。前期假设DRG中P2X3、P2X7、P2Y12受体参与神经元与卫星胶质细胞之间的病理性相互作用,进而介导gp120+dd C诱发的周围神经病理痛,实验观察相关嘌呤受体拮抗剂及嘌呤受体短发夹核糖核酸(short hairpin RNA,sh RNA)质粒干扰、中药单体穿心莲内酯等作用的效应。研究应用蛋白印迹、实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q PCR)、免疫组织化学、免疫荧光双标等常规实验技术与生物信息学预测技术、全细胞膜片钳、细胞钙成像等实验技术,将细胞水平实验与动物整体实验相结合,探究细胞ATP分泌水平、炎性因子表达水平、相关嘌呤受体表达变化及其下游信号通路激活参与卫星胶质细胞及神经元异常相互作用的病理过程,了解相关嘌呤受体在gp120或gp120+dd C诱发周围神经病理痛中的作用,以期阐明HIV感染与HAART诱发周围神经病理痛的发病机制及病理过程。通过以上实验,观察HIV联合HAART诱发神经病理痛的药物干预效应,为其防治提供新的实验依据。第2章P2X3受体介导HIV gp120诱发神经病理痛目的:探讨大鼠DRG神经元中P2X3受体在gp120诱发神经病理痛中的作用。方法:建立gp120海绵浸浴坐骨神经诱发周围神经病理痛大鼠模型,行为学检测大鼠机械痛敏与热痛敏变化,分子对接预测A317491与gp120蛋白的相互作用,实时定量PCR(q PCR)、蛋白印迹、免疫组织化学法检测大鼠DRG中P2X3受体表达水平,蛋白印迹检测细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinase 1/2,ERK1/2)的表达及其磷酸化水平,ATPlite 1 step检测神经元ATP释放水平,全细胞膜片钳检测P2X3受体选择性激动剂α,β-methylene ATP(α,β-me ATP)激活电流,观察P2X3受体拮抗剂A317491对模型大鼠的作用。结果:gp120模型大鼠机械痛敏与热痛敏均高于假手术组,大鼠DRG中P2X3受体表达、ERK1/2磷酸化水平等均高于假手术组;原代培养DRG神经元ATP释放水平、α,β-me ATP激活电流均高于对照组神经元;分子对接方法显示A317491与gp120存在相互作用,gp120模型加A317491作用组大鼠机械痛敏与热痛敏较gp120模型组大鼠减轻,且DRG中P2X3受体表达、ERK1/2磷酸化水平比模型组降低;gp120与A317491共处理的原代培养DRG神经元ATP释放水平、α,β-me ATP激活电流比gp120组神经元降低。结论:大鼠DRG神经元中P2X3受体介导gp120诱发的周围神经病理痛,A317491下调P2X3受体表达可减少神经元ATP释放、抑制神经元的异常兴奋、阻断其下游作用信号通路的激活,从而减轻模型大鼠神经病理痛样痛行为。第3章P2Y12受体介导HIV gp120加dd C诱发神经病理痛目的:探讨大鼠DRG SGCs中P2Y12受体在gp120加dd C诱发神经病理痛中的作用。方法:建立gp120海绵浸浴坐骨神经加dd C腹腔注射联合作用诱发周围神经病理痛大鼠模型,行为学检测大鼠机械痛敏与热痛敏变化,q PCR、蛋白印迹检测大鼠DRG中P2Y12受体表达水平、炎性因子白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达、丝裂原活化蛋白激酶p38 MAPK的表达及其磷酸化水平,免疫荧光双标检测P2Y12与SGCs标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)共表达,钙成像检测原代培养SGCs细胞内P2Y12受体激动剂2-Me SADP诱发的钙离子([Ca2+]i)变化,构建并筛选P2Y12 sh RNA干扰质粒,观察P2Y12 sh RNA对gp120+dd C模型大鼠的作用。结果:gp120+dd C模型大鼠机械痛敏与热痛敏均高于假手术组,且模型大鼠DRG中P2Y12受体表达、炎性因子IL-1β与TNF-α表达、p38 MAPK磷酸化水平等均高于假手术组,大鼠DRG中P2Y12受体与卫星胶质细胞标志物GFAP共表达较假手术组增加;原代培养DRG SGCs中2-Me SADP诱发的[Ca2+]i升高水平大于对照组SGCs;gp120+dd C+P2Y12 sh RNA干扰组大鼠机械痛敏与热痛敏较gp120+dd C模型组大鼠减轻,且DRG中P2Y12受体表达、IL-1β与TNF-α表达、p38 MAPK磷酸化水平比模型组降低;gp120+dd C+P2Y12 sh RNA共处理的原代培养DRG SGCs 2-Me SADP诱发的[Ca2+]i升高水平较gp120+dd C组SGCs减小。结论:大鼠DRG SGCs中P2Y12受体介导gp120加ddC诱发的周围神经病理痛,下调P2Y12受体表达,可抑制炎性因子释放,阻断其下游信号通路的激活,从而减少SGCs的激活及[Ca2+]i变化,改善SGCs与神经元间的病理性相互作用,减轻周围神经病理痛。第4章穿心莲内酯对P2X7受体介导的HIV gp120加dd C诱发神经病理痛作用研究目的:探讨中药单体穿心莲内酯对大鼠DRG SGCs中P2X7受体介导gp120加dd C诱发神经病理痛的作用及可能机制。方法:建立gp120海绵浸浴坐骨神经加dd C腹腔注射联合作用诱发周围神经病理痛大鼠模型,行为学检测大鼠机械痛敏与热痛敏变化,q PCR、蛋白印迹检测大鼠DRG中P2X7受体表达水平、IL-1β、TNF-α及IL-10表达、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的表达及其磷酸化水平,免疫荧光双标检测P2X7与SGCs标记物GFAP共表达,P2X7与神经元标记物Neu N共表达,钙成像检测P2X7受体激动剂Bz-ATP诱发的原代培SGCs细胞内[Ca2+]i变化,分子对接预测穿心莲内酯与P2X7受体蛋白的相互作用,观察穿心莲内酯对gp120+dd C模型大鼠的作用,并与P2X7受体拮抗剂A438079作用比较。结果:动物实验发现gp120+dd C模型大鼠机械痛敏与热痛敏均高于假手术组,且模型大鼠DRG中P2X7受体表达、促炎性细胞因子IL-1β与TNF-α表达、ERK1/2磷酸化水平等均高于假手术组,抗炎性细胞因子IL-10表达较假手术组降低,大鼠DRG中P2X7受体与GFAP共表达较假手术组增加,P2X7受体与Neu N无共表达;细胞实验发现原代培养DRG SGCs中Bz-ATP诱发的[Ca2+]i升高水平大于对照组SGCs;分子对接预测发现穿心莲内酯与P2X7受体蛋白存在相互作用,其结合位点在ATP与P2X7受体结合位点附近,可能对ATP与P2X7受体结合产生竞争性抑制作用。Gp120+dd C+穿心莲内酯组大鼠机械痛敏与热痛敏较gp120+dd C模型组大鼠减轻,且DRG中P2X7受体表达、IL-1β与TNF-α表达、ERK1/2磷酸化水平比模型组降低,抗炎性细胞因子IL-10表达较模型组升高;gp120+dd C+穿心莲内酯共处理的原代培养DRG SGCs组Bz-ATP诱发的[Ca2+]i升高水平较gp120+dd C组降低。结论:大鼠DRG SGCs中P2X7受体介导gp120加dd C诱发的神经病理痛,穿心莲内酯可下调P2X7受体表达,减少SGCs的激活及[Ca2+]i变化,改善SGCs与神经元间的病理性相互作用,抑制促炎性细胞因子释放,促进抗炎性细胞因子的释放,阻断其下游信号通路的激活,从而减轻模型大鼠神经病理痛样痛行为。
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