米黑霉脂肪酶活性的高通量筛选方法及其固定化和应用的研究

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脂肪酶即甘油酯水解酶,是一类专门水解油脂的酯酶。脂肪酶广泛应用于化学合成、食品、医药卫生、环保和能源开发等领域。其中来源于真菌米黑霉的脂肪酶RML (Rhizomucor miehei Lipase)是1,3-位专一性的脂肪酶,可以有效得制备各类油脂。在本文中,首先介绍了检测脂酶活性的几种方法及RML的一些酶学特性。其中p-NPP法只适合检测低酶活的脂酶;醋酸铜法和碱滴定法各有优缺点,但都适于检测脂酶酶活。RML在温度35-38℃,pH8-10之间表现出较好的活性。Cu2+抑制RML的活性,而Ca2+和Mg2+都能促进RML的活性。其次,开发了一种以橄榄油为催化底物的高通量筛选方法,并用于脂肪酶RML的定向进化。这个高通量方法的原理是利用脂肪酸和氯化钙反应生成可以通过pH指示剂检测的盐酸。与传统的p-NPP法比较,这个新方法展现了很多的优点:首先反应真实底物的活性;其次克服了p-NPP方法只能检测低酶活的缺点。新方法筛选出的突变酶,通过滴定法及液相检测,发现活性确实有所提高,而用p-NPP法筛选出的突变酶却不完全一致。通过运用该方法,RML经两轮定向进化后,我们成功筛选到酶活提高了5倍的优势菌。另外,脂酶的酯化活性也会随着水解活性提高。脂酶RML的1,3-位专一性没有改变。磁性纳米颗粒因其生物相容性、稳定性、特殊磁性和比表面积大而受到广泛的关注。通过丙烯酸乙酯与磁性Fe3O4的共聚反应,建立了一个在磁性纳米载体上共价结合固定化酶的方法。因为这个方法利用叠氮基固定化酶,不接触任何化学物质,所以避免了酶失活等问题。每克Fe3O4酶的装载量达到250毫克,而且保留活性为100%左右。即使重复使用10次,活性仍不变。1,3-甘油二酯(1,3-DAG)由于其广泛用途,尤其是对身体健康方面的作用而日益受到人们的重视。在本文中介绍了用酶法制备1,3-DAG的一些方法。其中通过脂酶RML酯化甘油和脂肪酸得到86%的油酸转化率和91%纯度的1,3-DAG.通过脂酶RML的酯化和水解作用,甘油解油脂得到82%的TAG转化率和41%纯度的1,3-DAG.
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