一、同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养及多向分化潜能鉴定目的探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞在体外的共培养,并行多向分化诱导鉴定。方法分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,Wright-Gemsa染色后观察其一般形态,以流式细胞仪行CD29、CD45、CD90表面标志物鉴定,并分别进行成骨细胞、成脂肪细胞诱导分化,分别以碱性磷酸酶、Von Cossa及油红染色鉴定。结果全骨髓直接培养法原代细胞形态不均一,但是增殖能力好;密度梯度法分离得到的细胞较为均一,但增殖力不如全骨髓直接培养法;经过3代传代后,细胞均可获得相对纯化。共培养细胞增殖力较好,细胞形态较为均一,且未出现因免疫排斥导致的细胞死亡。Wright-Gemsa染色结果显示共培养细胞呈典型梭形。流式细胞仪检测显示共培养细胞阳性表达CD29、CD90,阴性表达CD45。共培养之大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后分别出现成骨细胞和脂肪细胞形态,经碱性磷酸酶、VonCossa染色证实为成骨细胞,经油红染色证实为脂肪细胞。结论采用全骨髓直接培养及密度梯度离心法,经3～5代培养后均可获得相对纯化之骨髓间充质干细胞。同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养生长良好,不发生免疫排斥,证实该类细胞的极低免疫原性。在体外,共培养之大鼠骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,表明其具有多向分化潜能。二、同种异体大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定目的探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞在体外的共培养,并行神经分化诱导鉴定。方法分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,进行神经方向诱导,并行Nestin,NSE,GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果共培养之大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态,经Nestin,NSE,GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论同种异体共培养之骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞,提示移植入体内后,在适当环境下可分化为神经细胞。三、脊髓损伤大鼠中同种异体骨髓间充质干细胞经脑脊液向损伤区的迁移目的研究自脊髓损伤大鼠腰椎水平注射入蛛网膜下腔之同种异体骨髓间充质干细胞经脑脊液向损伤区的迁移。方法分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,以腺病毒转染EGFP基因。取成年SD大鼠20只,随机分为3组:对照组4只;模型组8只,治疗组8只。模型组与治疗组以改良Allen法复制大鼠下胸段脊髓损伤模型,对照组仅咬除相应节段棘突及椎板,不干预脊髓。造模后7天,于腰椎水平(L4-L5间隙)蛛网膜下腔向对照组及治疗组注射经EGFP标记之BMSCs,模型组注射同体积的Hank’s缓冲液。观察各组动物造模前后及移植前后后肢运动功能,以BBB评分对其进行评估,各组分别于移植后7天、14天随机选取一半动物处死取损伤节段为中心脊髓,纵向切开脊髓后,一半行冰冻切片,于荧光显微镜下观察移植细胞向脊髓损伤区的迁移情况;另一半石蜡包埋后行HE染色,于光学显微镜下观察脊髓损伤区的细胞聚集情况。结果三组动物造模术前BBB评分均为21分(满分)。术后第一天,对照组动物BBB评分恢复至21分。模型组和治疗组动物造模术后第3、7天BBB评分均低于对照组,有极显著性差异(P＜0.01),但两组间比较无显著性差异(P＞0.05)。两组动物自主排尿功能均在造模术后3天内恢复。BMSCs以Ad5F35-EGFP腺病毒转染后24h,荧光显微镜下即可见少量细胞表达绿色荧光。48h后,荧光显微镜下见大量细胞表达绿色荧光。经蛛网膜下腔注射EGFP标记之BMSCs后,治疗组动物从移植术后第1天开始,BBB评分持续增加。模型组动物BBB评分变化不大。移植术后第7天,模型组与治疗组动物BBB评分分别恢复至6.00±1.60和8.13±1.96分,与对照组相比均有极显著性差异(P＜0.01),且两组间比较亦有显著性差异(P＜0.05)。荧光显微镜下观察,EGFP标记之BMSCs移植后7天、14天,对照组与治疗组切片均见绿色荧光表达,模型组未见荧光表达。脊髓组织HE染色结果显示:移植后7天、14天,对照组切片脊髓结构正常;治疗组切片脊髓损伤区可见空洞,在脊髓面向蛛网膜下腔一面见大量细胞聚集;模型组切片脊髓损伤区见较大空洞,未见明显细胞聚集。结论由腰椎水平蛛网膜下腔注入之EGFP标记BMSCs可经脑脊液向大鼠下胸段脊髓损伤区迁移,并改善脊髓损伤大鼠后肢运动功能。从临床角度看,如采用BMSCs治疗脊髓损伤,经腰椎穿刺注射是一种更简单、微创的术式。四、同种异体骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠脊髓神经细胞凋亡的影响目的探讨骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的潜在抗凋亡机制。方法6周龄雄性SD大鼠8只,用于BMSCs分离培养。成年雄性SD大鼠84只,根据移植术后取材时间点随机分为6组,每组14只:A1.对照组,14天:A2.对照组,28天;B1.模型组,14天;B2.模型组,28天;C1.治疗组,14天;C2.治疗组,28天。模型组与治疗组以改良Allen法复制大鼠下胸段脊髓损伤模型,对照组仅咬除相应节段棘突及椎板,不干预脊髓。造模后7天,于腰椎水平(L4-L5间隙)蛛网膜下腔向对照组及治疗组注射BMSCs,模型组注射同体积的Hank’s缓冲液。观察各组动物造模前后及移植前后后肢运动功能,以BBB评分对其进行评估。按组别分别于移植后第14天、第28天处死动物,其中每组8只以损伤节段或相应节段为中心灌注后取脊髓组织,石蜡包埋后行HE染色,原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧尿苷三磷酸(d-UTP)缺口末端标记技术(TUNEL)染色,Bcl-2、Bax免疫组织化学染色;5只以损伤节段或相应节段为中心直接取脊髓组织,提取RNA后,行RT-PCR,检测Bcl-2、Bax基因的表达:1只于损伤中心或相应区域直接取1mm×1mm×1mm脊髓组织块,行透射电子显微镜观察。结果三组动物造模术前BBB评分均为21分(满分)。术后第一天,对照组动物BBB评分恢复至21分。模型组和治疗组动物造模术后第3、7天BBB评分均低于对照组,有极显著性差异(P＜0.01),但两组间比较无显著性差异(P＞0.05)。两组动物自主排尿功能均在造模术后3天内恢复。BMSCs移植后,治疗组动物BBB评分持续增加,但仍低于对照组,有极显著性差异(P＜0.01),模型组动物BBB评分变化不大。从移植术后第7天开始,治疗组动物BBB评分均高于模型组,有极显著性差异(P＜0.01)。脊髓组织HE染色结果表明:移植后14天、28天,对照组切片脊髓结构正常。模型组和治疗组切片均可见脊髓损伤空洞,模型组更为明显。透射电镜观察显示,移植术后14天、28天,对照组凋亡细胞均较少,未见明显坏死细胞。模型组可见大量凋亡细胞及坏死细胞。治疗组凋亡坏死细胞均较模型组少。移植后14天,模型组TUNEL阳性细胞数量多于对照组和治疗组,并有显著性差异(P＜0.01),阳性细胞主要分布于白质中。治疗组亦高于对照组,有显著性差异(P＜0.01)。移植后28天,各组TUNEL阳性细胞数量均减少,模型组仍然高于对照组和治疗组,但无显著性差异。移植后14天,模型组Bax阳性细胞表达多于对照组和治疗组,且有显著性差异(P＜0.01),治疗组Bax阳性细胞表达多于对照组,亦有显著性差异(P＜0.01)。而模型组Bcl-2阳性细胞表达少于对照组和治疗组,但无显著性差异。移植后28天,Bax阳性细胞表达减少,模型组仍然高于对照组和治疗组,但无显著性差异。Bcl-2阳性细胞表达变化不大。RT-PCR结果表明,移植后14天、28天,模型组Bax基因表达均强于对照组和治疗组,而Bcl-2基因表达弱于对照组和治疗组,但其光密度比较均无显著性差异。结论经蛛网膜下腔注射BMSCs可改善大鼠下胸段脊髓损伤模型的后肢运动功能,同时减少神经细胞的凋亡,降低Bax基因及其蛋白的表达,增加Bcl-2基因及其蛋白的表达。提示BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤具有潜在抗凋亡作用,这一作用很有可能是通过对凋亡调控基因Bax和Bcl-2的影响而实现的。五、同种异体骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠应激状态及中枢AMPA受体蛋白表达的影响目的探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠应激状态及海马和杏仁核AMPA受体蛋白表达的影响。方法成年雄性SD大鼠48只,根据移植术后取材时间点随机分为6组,每组8只:A1.对照组,14天;A2.对照组,28天;B1.模型组,14天;B2.模型组,28天;C1.治疗组,14天;C2.治疗组,28天。模型组与治疗组以改良Allen法复制大鼠下胸段脊髓损伤模型,对照组仅咬除相应节段棘突及椎板,不干预脊髓。造模后7天,于腰椎水平(L4-L5间隙)蛛网膜下腔向对照组及治疗组注射BMSCs,模型组注射同体积的Hank’s缓冲液。观察各组动物造模前后及移植前后后肢运动功能,以BBB评分对其进行评估,并记录同时段动物体重。按组别分别于移植后第14天、第28天处死动物,取血,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆ACTH和血清皮质酮含量;灌注后取脑,冰冻切片后行GluR1、GluR2免疫组织化学染色。结果三组动物造模术前BBB评分均为21分(满分)。术后第一天,对照组动物BBB评分恢复至21分。模型组和治疗组动物造模术后第3、7天BBB评分均低于对照组,有极显著性差异(P＜0.01),但两组间比较无显著性差异(P＞0.05)。两组动物自主排尿功能均在造模术后3天内恢复。BMSCs移植后,治疗组动物BBB评分持续增加,但仍低于对照组,有极显著性差异(P＜0.01),模型组动物BBB评分变化不大。从移植术后第7天开始,治疗组动物BBB评分均高于模型组,有极显著性差异(P＜0.01)。由于手术的干扰,三组动物在造模手术后体重均下降,术后逐渐恢复,至移植前,对照组体重高于模型组和治疗组,但无显著性差异(P＞0.05)。同样由于手术的干扰,各组动物体重在移植手术后均有明显降低。之后各组动物体重呈增加趋势,对照组体重增加快于同时段模型组和治疗组,从移植术后3天开始,差异有显著性意义(P＜0.05或P＜0.01)。从移植术后7天开始,各时段治疗组体重均高于模型组,但无显著性差异(P＞0.05)。移植后14天(即脊髓损伤后21天),模型组血浆ACTH较对照组和治疗组高,皮质酮比正常组要低。移植后28天(即脊髓损伤后35天),模型组ACTH下降,接近正常值,皮质酮持续升高。移植术后14天,GluR1阳性细胞数,模型组和治疗组在CA1区均高于对照组,均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01),在其他区无显著性差异;GluR2阳性细胞数有类似趋势,但均无显著性差异。移植术后28天,GluR1阳性细胞数,模型组在CA1、CA3、DG区均高于对照组,在CA1、CA3区亦高于治疗组,且均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01),模型组和治疗组在DG区均高于各自移植后14天阳性细胞数,均有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01);GluR2阳性细胞数,治疗组在BLA区高于对照组,且有显著性差异(P＜0.05),在其他区域各组虽表现出与GluR1表达类似的趋势,但均无显著性差异。结论BMSCs移植可改善大鼠下胸段脊髓损伤模型的后肢运动功能,同时可缓解脊髓损伤大鼠的慢性应激状态,其可能的机制为通过对AMPA受体蛋白GluR1及GluR2表达的影响而实现。