盐分胁迫主要包括渗透胁迫及离子胁迫。渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等，严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态，造成植物细胞分子损伤，生长减缓甚至死亡。 本实验以典型的积盐型盐生植物盐地碱蓬为材料，分两部分探讨了盐胁迫下液泡膜Ca2-ATPase、Ca2+/H+antiporter和H+-ATPase在植物抗盐中的作用。第一部分主要是对盐地碱蓬进行Ca2+、Na+处理，测定有关生理指标及液泡膜H+-ATPase、Ca2+-ATPase活性并对H+-ATPase进行Western-blot免疫杂交。第二部分主要是克隆了盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+antiporter的基因SsCAX1并进行表达特性分析，同时构建了含有SsCAX1的酵母表达载体和植物表达载体分别转化酵母突变体K667和拟南芥，以分析此基因的主要功能及过量表达对拟南芥耐盐性的影响，其主要结果如下： 1.Ca2+、Na+处理对盐地碱蓬生长的影响盐对盐地碱蓬生长的影响依赖于根际Ca2+供给水平。Ca2+供应充分的条件下，NaCl处理使植株相对生长量明显增加。但在Ca2+处理浓度为0mmol/L情况下，NaCl处理对整株植物的生长无显著作用。说明了Na+对盐地碱蓬生长的促进作用依赖于一定浓度的外源Ca2+。 2.Ca2+、Na+处理对盐地碱蓬叶片K+、Na+、Ca2+等无机离子含量的影响盐地碱蓬叶片细胞汁液K+、Ca2+浓度随盐处理浓度的增大而降低，细胞汁液Na+浓度变化则相反。但在缺Ca2+培养条件下，细胞汁液K+、Ca2+浓度随盐处理浓度升高而下降的幅度明显大于高Ca2+培养条件下(P＜0.05)。结果说明增加外源Ca2+可能通过增加K+的吸收来降低Na+在植物中的积累。 3.Ca2+、Na+处理对盐地碱蓬叶片细胞质膜透性的影响非盐胁迫条件下，盐地碱蓬叶片细胞质膜透性无明显变化。随着盐处理浓度的升高质膜透性升高，并且缺Ca2+条件下质膜透性升高的幅度高于Ca2+充分条件下的。结果表明尽管盐土中的Na+能破坏质膜的完整性和功能，但增加外源Ca2+能缓解Na+的这些伤害。 4.Ca2+、Na+处理对盐地碱蓬叶片液泡膜微囊V-H+-ATPase、Ca2+-ATPase活性及V-H+-ATPase亚基蛋白量的影响 不同Ca2+、Na+处理对盐地碱蓬液泡膜微囊质子泵，钙泵活性有重要影响。根际Ca2+供应充足(20mmol/L)时，盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPase活性明显受Na+刺激；而根际缺Ca2+时，液泡膜V-H+-ATPase活性变化不明显，仅在100mmol/LNaCl处理时稍有增加，但在400mmol/LNaCl处理时活性与对照无明显差异。无论有无外源Ca2+，Ca2+-ATPase活性随盐处理浓度无显著变化，但在有Ca2+条件下，Ca2+-ATPase活性比无Ca2+条件下的高。 Western-blot免疫沉淀结果表明，在缺Ca2+培养条件下，无盐处理时，盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPaseA、B、D及小c亚基有较高表达，但随着盐处理各亚基蛋白量无显著变化；在20mmol/LCa2+条件下，V-H+-ATPase各亚基蛋白量受盐处理增加。 5.盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+antiporter基因克隆及序列分析根据GeneBank中已知的Ca2+/H+antiporter的cDNA和蛋白序列寻找保守区以合成简并引物。用100mmol/LCaCl2处理盐地碱蓬16h，提取叶片的mRNA并反转录成cDNA，以此作为模板进行PCR扩增，得到一条中间片段。经过测序后进行Blast分析与Ca2+/H+antiporter的同源性较高。根据中间片段利用5，、3，-RACE分别合成其5、3端序列。最终得到一条完整的Ca2+/H+antiporter基因，命名SsCAX1，这是迄今第一个从盐生植物中克隆得到的液泡膜Ca2+/H+antiporter基因。此基因cDNA序列(GeneBankaccessionnumberAY518204)全长1596bp，包括172bp的5-非编码区和53bp的3-非编码区。 6.盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+antiporter基因的表达特性分析Northern分析表明，100mmol/LCaCl2处理下，生长四周的盐地碱蓬叶片SsCAX1基因表达明显受CaCl2诱导。在处理初期随处理时间的延长，盐地碱蓬叶片SsCAX1基因表达量增加，到24小时达到最大；尔后，随处理时间的延长，盐地碱蓬叶片SsCAX1基因表达量逐渐降低，但仍明显高于对照。这表明CaCl2处理下，盐地碱蓬叶片SsCAX1基因表达存在动态变化。 分离盐地碱蓬植株的根、茎、叶总RNA进行组织特异性分析发现，SsCAX1基因仅在叶中有表达，而在茎和根中基本没有表达。 酵母突变体K667由于缺失Ca2+-ATPase及Ca2+/H+antiporter而不能生长在高Ca+条件下，将SsCAX1利用LiAc转化方法转到酵母K667中，发现K667能在含有200mmol/LCaCl2的培养基上生长。初步说明SsCAX1具有Ca2+/H+antiporter活性。 利用制备的SsCAX1的抗体SsCAX1△1-70进行碱蓬叶片细胞质膜和液泡膜蛋白的免疫印迹杂交，发现SsCAX1蛋白主要分布在叶片细胞液泡膜上。 过量表达盐地碱蓬SsCAX1基因的拟南芥植株比野生型拟南芥植株对盐更敏感。在正常MS培养基上，转基因植株的生长与野生型植株没有明显差异，说明外源基因的插入和过量表达并没有影响植物的正常生长。在不含Ca2+的MS培养基上，野生型植株叶色较绿，根生长正常，而转基因植株根生长明显受到抑制。 在含75mmol/LNaCl的MS培养基上萌发并生长的转基因拟南芥植株其叶色、根发育均明显差于野生型植株。将在MS培养基上生长10天的野生型及转基因拟南芥幼苗转移到含10mmol/LLiCl的MS培养基上继续生长两周，转基因植株白化死亡而野生型植株尽管叶变黄但仍能存活。在含15mmol/LLiCl的MS培养基上继续生长一周，转基因植株侧根的生长明显弱于野生型植株。 总之，盐生植物抗盐性与胞质维持正常的离子稳衡态有关。盐胁迫破坏了细胞胞质中离子稳态，尤其是K+、Ca2+、Na+三种离子。盐胁迫下盐地碱蓬液泡膜H+-ATPase各亚基基因的转录和蛋白含量增加，进而增大了H+-ATPase的活性，为液泡膜Na+/H逆向转运蛋白和Ca2+/H+逆向转运蛋白提供了更多的质子驱动力，促进了Na+/H+逆向转运蛋白和Ca2+/H+逆向转运蛋白的活性，从而促成了液泡Na+区隔化及胞质Ca2+的回运。一方面减小了Na+的毒害，另一方面维持了胞质中正常的Ca2+浓度有利于Ca2+信号通路正常的运行。若过量表达盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+逆向转运蛋白基因SsCAX1，则会明显降低拟南芥植株的耐盐性。进一步证实了，维持正常的胞质Ca2+浓度对植物抗盐起重要作用，为利用分子生物学手段进行作物耐盐新品种的培育奠定一定基础。 本论文创新点：1.证明了盐生植物盐地碱蓬抗盐能力是Ca2+依赖性的。2.本实验利用不同浓度外源Ca2+和不同浓度的NaCl混合处理，证明了NaCl胁迫对盐生植物碱蓬叶片V-H+-ATPase活性的影响是Ca2+依赖性的，并且其活性的变化是此酶亚基蛋白量的变化引起的，说明，在NaCl处理条件下Ca2+在分子水平上调节盐生植物碱蓬V-H+-ATPase活性。 3.通过对盐地碱蓬液泡膜V-H+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的测定，初步认为盐生植物碱蓬在盐胁迫下主要靠Ca2+/H+antiporter来维持胞内Ca2+的稳衡态。此特点不同于非盐生植物。 4.从盐地碱蓬克隆了液泡膜Ca2+/H+antiporter的基因，并命名为SsCAX1。这是迄今第一个从盐生植物中克隆得到的液泡膜Ca2/H+antiporter基因。 5.对盐地碱蓬液泡膜SsCAX1表达特性分析发现，此基因仅在叶片中表达，并且表达量较高。而在根和茎中的表达量检测不到。这种表达特性也不同于拟南芥等非盐生植物。 6.将SsCAX1利用LiAc转化方法转到酵母突变体K667中，发现K667能在含有200mmol/LCaCl2的培养基上生长。初步说明SsCAX1具有Ca2+/H+antiporter活性。 7.构建了含有盐地碱蓬液泡膜SsCAX1的植物表达载体并转化拟南芥，发现转基因植株的盐敏感性增强。进一步验证了维持胞质Ca2+稳态平衡在植物抗逆性建立过程中的重要作用。