PIG11诱导HepG2细胞凋亡及其机制的初步探讨

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目的:构建人PIG11的miRNA表达载体pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,建立低表达PIG11基因的HepG2细胞株,联合采用本课题组前期已建立的PIG11蛋白稳定高表达HepG2细胞株,探讨PIG11蛋白表达对HepG2细胞凋亡的影响,以及ROS和Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白表达在凋亡过程中的作用。阐明PIG11诱导细胞凋亡的分子机制。方法:构建4个miRNA表达质粒,转化至感受态细菌DH5α挑取克隆测序。在脂质体2000的协助下转染HepG2细胞,经BSD筛选,获得稳定PIG11蛋白低表达的HepG2细胞。RT-PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白质水平鉴定4组载体转染HepG2细胞后PIG11的表达情况,从中选取干扰效果最好的1组作为PIG11蛋白低表达的HepG2细胞模型。故后续实验分组为HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞(空载体组细胞)、pLXSN-PIG11-HepG2细胞(PIG11高表达组细胞)、miR-PIG11-HepG2细胞(PIG11低表达组细胞)、miR-NC-HepG2细胞(干扰错义序列组细胞)。利用MTT法和平皿克隆形成实验检测细胞的生长情况;PI染色流式细胞术检测其凋亡效应;DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS,流式检测ROS水平的改变;Western Blot测定Survivin、Caspase3、Caspase9蛋白的表达情况。结果:成功构建4组人PIG11的miRNA表达载体pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR,基因测序正确。转染后获得稳定细胞株,测定结果显示转染第4组干扰质粒的HepG2细胞PIG11 mRNA水平最低(p<0.01),PIG11蛋白表达最低(p<0.01)。实验显示:pLXSN-PIG11-HepG2细胞生长减慢(p<0.01),miR-PIG11-HepG2细胞生长加快(p<0.01),pLXSN-HepG2细胞、miR-NC-HepG2细胞、HepG2细胞各组间生长差异无显著性。结果显示:HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR-NC-HepG2细胞的凋亡率分别为5.72%±0.81、5.34%±0.60、34.83%±2.29、1.34%±0.71、5.10%±0.40。pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率比其它各组增高(p<0.01),miR-PIG11-HepG2细胞凋亡率降低(p<0.01)。HepG2细胞、pLXSN-HepG2细胞、pLXSN-PIG11-HepG2细胞、miR-PIG11-HepG2细胞、miR-NC-HepG2细胞的ROS水平分别为5.52±0.97、4.92±0.71、15.71±0.82、2.39±0.22、5.12±0.15,pLXSN-PIG11-HepG2细胞ROS水平高于其余各组(p<0.05),miR-PIG11-HepG2细胞ROS水平低于其余各组(p<0.05)。使用ROS清除剂NAC后,各组细胞内的ROS水平降低,流式凋亡检测各组细胞凋亡显示pLXSN-PIG11-HepG2细胞凋亡率为16.2%±1.18较原来降低(p<0.05),余各组细胞凋亡率变化不明显。使用MPTP抑制剂CsA后, pLXSN-PIG11-HepG2细胞组ROS水平降低至8.12±0.92(p<0.05),余各组细胞变化不明显。pLXSN-PIG11-HepG2细胞中Caspase3、Caspase9蛋白表达上调(p<0.01),Survivin蛋白表达下调(p<0.01),miR-PIG11 -HepG2细胞中Caspase3、Caspase9蛋白表达下调(p<0.01),Survivin蛋白表达上调(p<0.01)。结论:建立了PIG11低表达的稳定细胞模型;PIG11高表达能抑制HepG2细胞生长和诱导其凋亡;PIG11诱导细胞凋亡与胞内ROS变化和Caspase3,9蛋白表达上调及Survivin蛋白表达下调有关。
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