卵巢癌靶向多肽的筛选及初步鉴定

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研究背景 卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是致死率最高的女性生殖器官恶性肿瘤,且呈年轻化发病趋势。卵巢癌无典型的早期症状,大多数患者就诊时已达进展期,III期和IV期患者5年总的存活率低于30%。然而,对于诊断为I期和II期的患者,5年生存率可高达89%和71%。手术治疗是卵巢癌目前主要的治疗手段,放化疗为辅助治疗。由于卵巢癌患者的预后与诊断时的分期及早期治疗息息相关,因此,寻找新的有效的早期筛查方法,提高其早期诊断率是卵巢癌防治所面临的关键问题之一。Smith在1985年提出了一种独特的基因重组表达方法,即噬菌体展示技术(phage display technology)。该技术是在噬菌体基因组中插入编码多肽的DNA,获得对目标分子具有高亲和力和选择性的蛋白质或多肽,而且可以在没有抗体特异性相关信息的情况下识别配体。目前已广泛应用于分子成像、疫苗研发、抗体工程、癌症研究等不同生物医学领域。近年来,通过噬菌体展示技术生物淘选方法已经分离出了许多癌症特异性结合肽,如食管癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、宫颈癌等。综合上述背景,通过噬菌体展示技术筛选靶向卵巢癌特异性多肽,为卵巢癌早期筛查和诊断、药物靶向治疗以及疗效评估提供新思路。研究目的 通过噬菌体展示技术以期得到与人卵巢癌SKOV3细胞特异性结合多肽序列;经过多方法鉴定多肽靶向结合卵巢癌细胞的能力,探讨其在卵巢癌早期筛查、早期诊断及靶向治疗中的应用价值。研究方法1.通过优化噬菌体展示技术的体外全细胞消减筛选方法,以HEK293细胞为阴性筛选细胞,卵巢癌SKOV3细胞为目标筛选细胞,在噬菌体随机12肽库中筛选与靶细胞特异性结合的噬菌体。2.经过4轮筛选后,从未经扩增的噬菌体洗脱液的滴定平板上,随机挑取蓝色噬菌体单菌落进行扩增、纯化并测定滴度,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)初步鉴定随机选取的噬菌体单克隆与卵巢癌SKOV3结合的相对能力。3.DNA测序分析并进行同源性分析。4.细胞免疫荧光及流式细胞术鉴定噬菌体单克隆的靶向特异性。研究结果1.经过4轮全细胞消减筛选后,噬菌体的回收量从3.7×106pfu提升至1.26×108pfu,回收量明显提高,回收率增加了34倍,提示与卵巢癌SKOV3细胞亲和力较高的噬菌体克隆得到富集。2.利用ELISA方法,从54个随机挑选的噬菌体单克隆中得到32个阳性克隆。3.DNA测序分析得到12条多肽序列,经BLAST检测,均与已知蛋白不同程度同源。4.细胞免疫荧光及流式细胞术显示,OSP2肽序的代表克隆S36靶向结合卵巢癌SKOV3的能力最强,且相比于其他克隆,特异性最高,确定噬菌体克隆S36为最佳阳性克隆。结论OSP2肽序的代表性克隆S36是与卵巢癌SKOV3细胞高亲和力及特异性结合的多肽,有望成为卵巢癌早期筛查、诊断及药物靶向治疗的多肽探针。
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