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目的细胞周期调控机制的紊乱,导致细胞无限制地增殖,是恶性肿瘤发生的主要机制之一。S期激酶相关蛋2(S-phase kinase associated protein 2 , Skp2)是DNA复制所必需的人类F-box蛋白家族中一员,在泛素依赖性蛋白水解途径中起到特异性识别底物的作用,从而参与细胞周期的调控。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能高效特异干涉目标靶基因的表达,可作为一种简单有效的代替基因敲除的工具。前期实验通过realtime-PCR法及CCK-8法证实Skp2-siRNA能有效抑制Eca-109食管癌细胞mRNA表达水平及其增殖情况。本实验继续通过构建Skp2基因特异性的小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)表达载体,在原有的基础上继续采用Skp2-siRNA干扰技术观察Eca-109食管癌细胞系转染前后Skp2及p21WAF1/CIP1蛋白表达及细胞周期的改变,进一步探求Skp2和p21WAF1/CIP1之间的关系及二者对食道癌细胞系细胞周期的影响,为临床针对Skp2基因的靶向治疗提供理论基础。方法以Eca-109食管癌细胞系作为实验对象,设计合成针对Skp2的siRNA并进行转染。实验分为转染组、空白对照组、转染对照组、阴性对照组。采用免疫细胞化学方法检测各组Eca-109食管癌细胞系Skp2及p21WAF1/CIP1蛋白表达的情况,采用HIPAS-2000型计算机图像采集系统,在×200倍视野中采集图像,用Imageproplus(IPP)分析测量图像软件测定阳性细胞的累积光密度值(integrated optical density,IOD)每张切片选5个视野并求其均值。流式细胞仪检测2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。所有数据采用方差分析进行组间均数比较,以p<0.05表示差异有统计学意义。结果1.将荧光标记的siRNA转染入Eca-109细胞6h后用荧光显微镜检测,计数转染Eca-109细胞的效率,转染效率>80%。2.常规细胞学观察,将Skp2-siRNA转染入Eca-109细胞24h后,细胞开始圆变小,比正常对照组细胞生长缓慢,48h后部分细胞有脱落,72h后细胞脱落变多。3.免疫细胞化学检测结果显示:应用Skp2-siRNA干扰Eca-109食管癌细胞系24h后Skp2蛋白表达开始下降,IOD值为5.74±0.21;48h后下降最明显,IOD值为2.81±0.19;72h后Skp2蛋白表达开始回升,IOD值为8.12±0.26。各组与空白对照组相比较,差异均有显著统计学意义(p<0.01),24h、48h和72h不同转染时间组之间差异亦有显著统计学意义(p<0.01)。转染对照组培养24h、48h、72h后Skp2的IOD值分别为13.35±0.17、13.10±0.21、14.02±0.23与空白对照组相比较差异无统计学意义(p>0.05)。阴性对照组培养24h、48h、72h后Skp2的IOD值分别为13.65±0.38、13.05±0.10、13.79±0.24与空白对照组相比较差异无统计学意义(p>0.05)。4.应用Skp2-siRNA干扰Eca-109食管癌细胞系24h后,p21WAF1/CIP1蛋白表达开始上升,IOD值为8.21±0.34;48h后上升最明显,IOD值为14.03±0.18;72h后p21WAF1/CIP1蛋白表达开始下降,IOD值为5.55±0.37。与空白对照组相比较,差异有显著统计学意义(p<0.01),且转染组24h、48h、72h之间差异亦有显著统计学意义(p<0.01)。转染对照组培养24h、48h、72h后p21WAF1/CIP1的IOD值分别为2.47±0.20、2.82±0.17、2.05±0.20与空白对照组相比较差异无统计学意义(p>0.05)。阴性对照组培养24h、48h、72h后p21WAF1/CIP1的IOD值分别为2.67±0.11、2.94±0.17、2.27±0.12与空白对照组相比较差异无统计学意义(p>0.05)。5.流式细胞仪检测结果显示:对Eca-109食管癌细胞系应用Skp2-siRNA干扰后,转染组的G1期细胞数比空白对照组明显升高,24h、48h、72h G1期细胞百分比数为49.00±1.72%、64.22±1.62%、55.44±1.26%,差异有显著统计学意义(p<0.01)。转染组24h、48h、72h之间G1期细胞百分比差异亦有统计学意义(p<0.05)。转染对照组培养24h、48h、72h后G1期细胞数39.46±1.03%、36.42±0.52%、37.58±1.34%与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。阴性对照组培养24h、48h、72h后G1期细胞数36.26±1.07%、36.97±1.13%、35.07±1.11%与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。对Eca-109食管癌细胞系应用Skp2-siRNA干扰后,转染组的S期细胞数比空白对照组减少,24h、48h、72h S期细胞百分比数为42.85±0.89%、32.88±1.30%、36.15±1.51%。转染组24h与48h、72h之间S期细胞百分比差异有显著统计学意义(p<0.01)。48h与72h之间S期细胞百分比差异无统计学意义(p>0.05)。转染对照组培养24h、48h、72h后S期细胞数45.18±1.47%、44.31±0.79%、44.70±1.34%与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。阴性对照组培养24h、48h、72h后S期细胞数43.10±0.85%、44.47±1.04%、46.34±1.41%与空白对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结论将人Skp2-siRNA转染入Eca-109食管癌细胞系后,能有效下调Eca-109食管癌细胞系Skp2蛋白的表达,同时上调p21WAF1/CIP1蛋白的表达,促使细胞周期停滞于G1期。RNAi技术有可能作为抑制肿瘤细胞生长的一种手段。