第一章网络药理学预测研究决明子治疗NAFLD的作用机制目的:构建决明子与疾病治疗靶点间的相互作用网络,预测决明子治疗非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）的潜在靶点和机制。方法:1.决明子活性成分及靶点挖掘:中药系统药理学数据库与分析平台、Pub Chem、Swiss Target Prediction、Pharm Mapper数据库检索决明子活性成分和靶点。2.NAFLD相关靶点挖掘:Gene Cards、OMIM、药物靶标数据库（Therapeutic target database,TTD）和Drug Bank数据库挖掘NAFLD靶点。3.蛋白质相互作用网络（Protein-protein interaction network,PPI）构建:R语言编程筛选决明子和NAFLD靶点交集,并将交集靶点导入String数据库构建PPI网络。4.PPI网络拓扑分析:利用Cytoscape 3.7.2软件计算度值、介度中心度和接近中心度等重要参数,筛选出核心靶点。5.基因本体论（Gene ontology,GO）功能富集和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集:上传基因列表至DAVID数据库生成富集结果,利用R语言编程使结果可视化。结果:1.共收集到决明子有效活性成分14个,主要为蒽醌类和苯并吡喃酮类;共检索到决明子作用靶点481个。合并疾病数据库靶点后,共挖掘到NAFLD靶点426个。R语言编程选取决明子与NAFLD靶点交集,获得76个交集靶点。2.PPI网络拓扑分析表明,该网络共有76个节点,154条边,节点度的均值为4.05,度值较高的靶点包括Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）、闭合蛋白（Occludin,OCLN）、紧密连接蛋白-1（Tight junction protein ZO-1,TJP1）,白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）。3.GO功能注释结果显示,分子功能（Molecular function,MF）主要涉及类固醇激素受体活性、蛋白酶结合、胰岛素受体底物结合等;细胞成分（Cellular component,CC）主要包括胞液、细胞外间隙、蛋白复合物等;生物过程（Biological process,BP）主要包括细胞对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的反应、细胞对胰岛素刺激的反应和凋亡程序的负调控等。4.KEGG通路富集分析表明,NAFLD、TLR、TNF、过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR）和胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）等信号通路可能与决明子治疗NAFLD相关。结论:决明子蒽醌类和苯并吡喃酮类活性成分可能通过干预LPS介导的慢性炎症,调节TLR、TNF、Occludin、TJP1等靶点和信号通路的转录表达,初步预测决明子可能影响炎症反应、肠道紧密连接和糖脂代谢等病理生理过程。第二章决明子橙黄决明素改善胆汁酸肠肝循环治疗NAFLD小鼠目的:评估决明子橙黄决明素（Aurantio Obtusin,AO）对NAFLD小鼠的治疗作用,并探讨该作用与胆汁酸肠肝循环的相关性。方法:1.48只体重24-28g的雄性昆明系小鼠随机分为对照组（CON）;高脂饮食组（HFD）;AO 1.5g/kg/d组;AO 3g/kg/d组;AO 5g/kg/d组;AO 8g/kg/d组,每组8只。CON组给予正常饮食,其余各组喂养高脂饮食（High-fat diet,HFD）12周,建立NAFLD模型。成功建立模型后,CON组和HFD组给予生理盐水灌胃,各用药组给予相应剂量的AO灌胃,给药4周后处死,取材并记录肝脏指数,在造模及给药期间每周记录一次体重。2.按试剂盒说明应用酶标仪检测肝脏胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）和血清总胆汁酸（Total bile acid,TBA）水平。3.H＆E染色观察肝组织肝细胞脂肪变、肝小叶内炎症和肝细胞气球样变等病理变化情况。4.q-PCR检测各组小鼠肝脏法尼醇X受体（Farnesoid X receptor,FXR）、小分子异源二聚体（Small heterodimer partner,SHP）、成纤维细胞生长因子受体4（Fibroblast growth factor receptor 4,FGFR4）、胆固醇7A羟化酶（Cholesterol7-alpha hydroxylase,CYP7A1）、CYP7B1、CYP8B1,以及肠道FXR、纤维母细胞生长因子15（Fibroblast growth factor 15,FGF15）m RNA表达。结果:1.与对照组相比,HFD小鼠体重和肝脏指数均显著升高（P＜0.001）;AO干预4周后,AO组小鼠体重和肝脏指数与HFD组相比显著降低（P＜0.001）。2.与CON组相比,HFD组小鼠肝脏TC、TG和血清TBA水平显著升高（P＜0.001）;AO各剂量组小鼠肝脏TC、TG和血清TBA水平呈剂量依赖式下降（P＜0.001）。3.对照组小鼠肝小叶结构完整,排列正常,肝细胞形态正常,未见脂滴和炎性细胞;HFD组小鼠有较多肝细胞脂肪变,存在大量的脂肪空泡和散在的炎性浸润;AO组小鼠肝细胞和肝小叶形态完整,仅见少量脂滴和炎性细胞。4.与CON组小鼠相比,HFD组肝脏FXR、SHP、FGFR4的m RNA表达显著升高（P＜0.05）,回肠FXR、FGF15的m RNA表达同样显著升高（P＜0.05）;肝脏胆固醇限速酶CYP7A1、CYP7B1、CYP8B1的m RNA表达显著降低（P＜0.05）。AO治疗显著下调了肝脏FXR、SHP、FGFR4（P＜0.05）和回肠FXR、FGF15的m RNA表达（P＜0.05）,并显著上调肝脏CYP7A1、CYP7B1、CYP8B1的m RNA表达（P＜0.01）。结论:决明子AO治疗可显著改善小鼠NAFLD,其机制可能与AO介导FXR天然拮抗机制,调节胆汁酸肠肝循环有关。第三章决明子橙黄决明素对NAFLD小鼠肠道生物屏障的保护作用目的:探讨AO对NAFLD的治疗作用与肠道菌群丰度和多样性的相关性,评估AO对NAFLD小鼠肠道生物屏障的保护作用。方法:1.粪便样本收集:将小鼠粪便收集到无菌EP管后迅速浸入冰盒防止样本DNA降解,随后转移至﹣80℃冰箱保存。2.DNA抽提和PCR扩增:按试剂盒说明书进行提取总DNA后紫外分光光度计测量DNA浓度和纯度,2%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测,V3-V4可变区使用338F和806R引物进行PCR扩增。3.Illumina Miseq测序:回收的PCR产物经纯化和洗脱后检测定量。根据Illumina Mi Seq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库,利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。4.生物信息学分析参照“Atacama soil microbiome tutorial”流程完成。结果:1.粪便肠道微生物物种组成分析结果显示,拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形杆菌门（Proteobacteria）占门水平的主要组成部分;与CON组相比,HFD组小鼠Firmicutes丰度显著升高（P＜0.001）,Bacteroidetes丰度显著下降（P＜0.001）,AO干预可显著降低Firmicutes丰度（P＜0.001）,并显著升高Bacteroidetes丰度（P＜0.01）;HFD组Firmicutes/Bacteroidetes比值与CON小鼠相比显著升高（P＜0.001）,AO组Firmicutes/Bacteroidetes比值则较HFD组显著降低（P＜0.001）。2.在属水平上,HFD组艾克曼菌（Akkermansia）丰度较CON组显著降低（P＜0.001）,AO干预可显著升高Akkermansia丰度（P＜0.001）,提示AO具有维持肠道黏液层完整性的功能,可降低肠道通透性调节肝脏免疫应答。与CON组相比,HFD组双歧杆菌（Bifidobacterium）丰度显著降低（P＜0.05）,AO干预可显著升高Bifidobacterium丰度（P＜0.05）,提示AO可促进肠道生物屏障形成,以减少肠源性内毒素的渗透。2.粪便菌群α多样性指数分析显示,与CON组相比,HFD组Chao1、Faith’s PD、Observed OTUs和Shannon指数均显著降低（P＜0.05）;AO治疗组小鼠肠道微生物Chao1、Faith’s PD、Observed OTUs和Shannon指数较HFD组显著升高（P＜0.05）。3.β多样性指数的主成分分析（Principal components analysis,PCA）和主坐标分析（Principal co-ordinates analysis,PCo A）显示3组间样品的距离较远,提示组间物种组成结构差异较大。偏最小二乘判别分析（Partial least squares Discriminant Analysis,PLS-DA）显示属于同一分组的样本彼此之间距离较近,同时不同分组的点之间距离较远,表明组间β多样性差异较大。结论:决明子AO可改善NAFLD小鼠肠道微生物多样性和丰度,并通过增加Akkermansia、Bifidobacterium菌属的丰度保护肠道生物屏障。第四章决明子橙黄决明素对NAFLD小鼠肠道机械屏障和免疫屏障的保护作用目的:探讨AO对NAFLD的治疗作用是否与修复肠道机械屏障,降低肠道通透性,从而减轻LPS诱导的肝脏炎症反应有关。方法:1.H＆E染色观察回肠上皮细胞间的紧密连接。2.q-PCR和蛋白印迹法检测各组小鼠回肠紧密连接分子Occludin和闭锁小带蛋白1（Zonula occludens 1,ZO-1）的m RNA和蛋白表达水平。3.酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组小鼠血浆脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）水平和肝组织匀浆中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。4.q-PCR和蛋白印迹法检测肝脏TLR4、核因子-κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）、p-NF-κB的m RNA和蛋白表达水平。5.关联统计分析:应用R软件包“vegan”和RDA分析方法揭示微生物群落与相关环境因子之间的潜在关联。结果:1.CON组小鼠肠道粘膜各层结构未见明显缺损,绒毛排列有序,上皮细胞形态呈高柱状;HFD组小鼠回肠组织绒毛萎缩,缺损断裂,上皮细胞紧密连接间隙增宽,黏膜上皮细胞坏死脱落,上皮层与固有层分离;AO组小鼠回肠绒毛形态好转,缺损程度较轻,肠黏膜上皮完整、形态正常。2.与CON组相比,HFD组小鼠回肠紧密连接分子Occludin、ZO-1 m RNA和蛋白表达显著降低（P＜0.05）;AO组小鼠回肠Occludin、ZO-1的m RNA和蛋白表达较HFD组显著增加（P＜0.001）,表明AO可修复上皮细胞间的紧密连接,保护肠道机械屏障,降低肠道通透性。3.HFD小鼠血浆LPS和肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平较对照组显著升高（P＜0.001）,AO干预可显著降低小鼠血浆LPS和肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平（P＜0.001）。4.与CON组相比,HFD小鼠肝组织TLR4和NF-κB的m RNA和蛋白表达显著增加（P＜0.001）,AO各剂量组肝组织TLR4和NF-κB的m RNA和蛋白表达水平与HFD组相比显著降低（P＜0.001）,表明AO可减轻内毒素血症,降低LPS由门静脉侵入肝脏,抑制LPS/TLR4/NF-κB通路介导的肝脏炎症反应,修复肝脏免疫屏障。5.RDA相关性分析表明,环境因子TG、LPS和炎症因子水平与群落分布和种类分布具有显著相关性（P＜0.05）。相关性热图显示,环境因子水平与大多数菌种在门水平显著相关（P＜0.04）,提示AO治疗前后的肝脂质沉积和LPS诱导的炎症反应程度与肠道微生物改变相关。结论:决明子AO可能通过修复上皮细胞间的紧密连接,减少肠源性LPS向门静脉易位,抑制LPS/TLR4/NF-κB通路,修复肝脏免疫屏障。