随着原子能在国防、工业、农业、医疗、科技等国民经济各领域的普及应用，核能在巨大造福人类的同时，也给当今世界带来了严重的核辐射危险，给人类的健康与安全带来了严峻的挑战。在前苏联切尔诺核电站事故给人类带来灾难性后果的记忆还没有完全消除之时，2010年3月日本强烈地震造成的福岛核电站放射性核泄露事故又引起了世界范围的核辐射恐慌。另一方面，放射治疗仍然是恶性肿瘤以及一些良性疾病的重要治疗手段，可是辐射在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常组织细胞造成损伤，限制了放疗的应用和发展。人类不得不思考如何在有效利用核能的同时又能确保自身的健康不受损害。肝脏是人体的重要器官，其功能包括分泌胆汁，摄入营养物质的代谢，消除废物，储存糖原，以及合成血浆蛋白等。然而在肝癌以及其他腹部肿瘤的放射治疗过程中，对正常肝细胞的损伤却是不容忽视的，由辐射造成的肝毒性所引的辐射相关肝损伤经常发生，成为放射治疗应用于肝内肿瘤治疗的最主要限制因素。肝脏也经常受到作用于上腹部、右下肺、食管远端肿瘤、整个腹部或全身放疗过程中的辐射照射，导致肝脏细胞和组织辐射损伤。如何降低辐射所造成正常组织细胞的损伤，探索高效、低毒的辐射防护剂始终是国内外辐射防护研究的重点和难点。2007年，Ohsawa等人发现氢气可以选择性减少细胞毒性氧自由基，发挥治疗性抗氧化作用。从此，在世界范围内掀起了研究氢气生物学效应的热潮。氢气能够选择性减少羟自由基的生物学效应引起了我们辐射防护研究者的兴趣，因为在辐射损伤中大部分损伤是由羟自由基所导致。电离辐射对生物体构成的损伤，主要来自直接作用和间接作用，其中间接作用引起的损伤占辐射损伤的70%-80%左右，羟自由基在其中发挥了重要影响。抑制或者清除辐射所产生的大量自由基，提高机体的抗辐射能力，从而保护机体组织和器官免受伤害，历来是辐射防护剂研究的重要途径之一。2008年，我教研室首次将氢气应用于辐射防护研究领域，制备了可安全使用的富H2溶液，探讨富H2溶液对体外培养细胞等的辐射防护效应，经实验证实这种富H2溶液具有良好的辐射防护效果，开辟了氢气用于辐射防护的先河。国内外目前用于肝脏等组织辐射防护的方法大多是利用天然植物提取物，细胞因子，以及化学合成的药物等，它们大多的不足主要是毒副作用大，或是防护效价太低。氢气选择性减少细胞毒性氧自由基的特性已被我们实验室证实对培养细胞、造血组织和心脏组织具有良好的辐射防护作用，但是未见国内外研究氢气对肝细胞和肝脏辐射损伤保护作用的报道。过去的研究已经表明辐射所造成的肝损伤很大一部分由辐射诱导的氧化应激所致，近年来有人证明用吸入氢气的方式可以减少化学物质氧化应激对肝细胞损伤，所以我们推测富H2溶液对肝脏可能具有很好的辐射防护作用。富H2溶液既解决了直接使用氢气易燃易爆的危险性，又使得氢气更易储存和更容易被机体所吸收，且其最大的优点还在于它基本无毒副作用。本课题以人肝细胞和小鼠肝脏为研究对象，探讨富H2溶液对它们的辐射防护效应，具有很好的临床应用前景。研究内容：1.富H2溶液对人肝细胞的辐射防护效应：选取人正常肝细胞HL-7702（L-02细胞）作为研究对象，建立细胞在不同照射剂量下的剂量存活曲线，在此基础上分别观察：①富H2溶液对γ射线照射后细胞存活率的影响；②富H2溶液对γ射线照射后细胞凋亡情况的影响。2.富H2溶液对小鼠肝脏的辐射防护效应：①富H2溶液对γ射线照后小鼠肝功能的影响；②富H2溶液对γ射线照后肝脏结构的影响；③富H2溶液对γ射线照后小鼠肝细胞凋亡的影响。3.初步探讨富H2溶液的辐射防护效应机制：①利用荧光探针标记检测γ射线照射后富H2溶液清除羟自由基的效果；②分析富H2溶液对γ射线照后小鼠肝脏氧化损伤指标羰基化蛋白（PC）及8-OHdG浓度的影响；③分析富H2溶液对照后细胞及小鼠肝脏中凋亡相关蛋白表达情况。④测定腹腔注射富H2溶液后小鼠肝脏中的氢浓度。实验方法：1.富H2溶液及培养基的制备：利用本实验室建立、优化的已常规应用的成熟方法制备富H2溶液。经氢电极检测氢气含量已达到过饱和状态（各种液体的氢气浓度分别为：富H2纯净水0.823mmol/L，富H2生理盐水0.809mmol/L；富H2PBS0.814mmol/L）。2.细胞培养：HL-7702（L-02）细胞为来源于人肝脏细胞系的建株细胞（购自上海市中科院细胞库）。细胞培养条件：RMPI-1640培养基（PAA公司），10%胎牛血清（PAA公司），37℃，5%CO2，饱和湿气，在细胞培养箱中孵育。3.细胞及小鼠γ射线照射：按照实验设计用钴－60γ射线照射，剂量率为1.0Gy/min。4.富H2溶液清除羟自由基的效果：利用HPF荧光探针标记检测。5.细胞存活率测定：Hoechst33342和PI双染检测不同处理细胞的存活率。细胞存活率（%）＝(PI染色细胞/Hoechst33342染色细胞数)×100%。6.细胞凋亡分析：用Annexin V/PI双染，利用流式细胞仪检测凋亡百分率的变化。7.腹腔注射富H2溶液后肝脏内氢浓度变化：利用氢电极在各时间点检测肝脏内氢浓度。8.小鼠肝功能检测：通过检测小鼠血液中谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）含量来衡量小鼠肝功能的变化情况。9.小鼠氧化指标的检测：通过标羰基化蛋白（PC）及8-OHdG Elisa试剂盒检测两种指标的浓度变化。10.小鼠肝脏结构的变化：利用HE染色切片观察病理变化，以及利用电镜观察显微结构的变化。11.小鼠肝细胞凋亡的检测：应用TUNEL原位凋亡检测试剂盒，检测处理后小鼠肝细胞的凋亡情况。12.凋亡相关蛋白的检测：利用Western blot检测处理过的人肝细胞及小鼠肝脏内凋亡相关蛋白的表达情况。13.统计方法：单组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，数值以表示， P＜0.05为有差异统计学意义。实验结果：1.富H2溶液对人肝脏细胞的辐射防护作用L-02细胞8Gy照射后24h，分别检测细胞的存活率和凋亡率。单纯照射组细胞死亡率为36.8%，富H2溶液组降为16.2%，与单纯照射组细胞相比富H2溶液组存活率明显提高(P＜0.01)；富H2溶液组细胞的凋亡率较单纯照射组显著降低，前者细胞凋亡率为8.5%，而后者细胞凋亡率高达18.6%（P＜0.01）。这些结果显示，富H2溶液对L-02细胞具有很好的辐射防护作用。2.富H2溶液对小鼠肝脏的辐射防护作用：2.1富H2溶液对受照小鼠肝功能的影响：经10Gy照射后2h检测小鼠外周血血清中的ALT及AST浓度，发现富H2溶液组小鼠外周血血清中ALT及AST浓度的峰值明显低于单纯照射组（P＜0.01）。2.2富H2溶液对受照小鼠肝组织病理改变的影响：通过对6.5Gy照射后第7天肝脏组织切片进行HE染色观察，发现单纯照射组的肝脏组织形态损伤严重，可以看到大量的核固缩细胞，而富H2溶液组的肝脏组织形态变化轻微，接近正常对照组；通过对双核细胞和不正常细胞进行计数分析，发现富H2溶液组的这两类细胞数量明显低于单纯照射组（P＜0.01）。2.3富H2溶液对受照小鼠肝细胞显微结构的影响：虽然经照射后两组肝细胞的线粒体都出现了损伤，但是单纯照射组肝细胞损伤明显比富H2溶液组严重，肝细胞内质网出现了大量的膨胀现象，核糖体数量减少，并且细胞核出现了固缩，有凋亡的趋势；而富H2溶液组肝细胞中内质网形态及核糖体数量基本无变化，细胞核形态也完好。2.4富H2溶液对受照小鼠肝细胞凋亡的影响：通过TUNEL染色观察细胞的凋亡情况，发现单纯照射组的TUNEL阳性率59%，而给药组的TUNEL阳性率为35.4%，与单纯照射组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。3.富H2溶液对肝脏辐射生物学效应的机理探讨3.1富H2溶液对受照肝细胞内羟自由基的清除作用：利用HPF探针检测8Gy照射后富H2溶液清除羟自由基的效果，发现富H2溶液组中HPF探针的荧光强度明显低于单纯照射组，与空白对照组中HPF探针的荧光强度相接近，说明富H2溶液对肝细胞内由辐射诱发产生的羟自由基有较强的的清除作用。3.2富H2溶液对受照小鼠肝脏内8-OHdG及PC的影响：小鼠经6.5Gy γ射线照射后4h时，通过8-OHdG及PC试剂盒检测单纯照射组和给药组照后8-OHdG及PC浓度，发现富H2溶液组小鼠肝脏内8-OHdG及PC浓度较单纯照射组有明显降低（P<0.01），说明富H2溶液可以显著减轻电离辐射所致的DNA损伤和蛋白氧化损伤。3.3富H2溶液对受照人肝细胞内凋亡相关蛋白表达的影响：L-02细胞在经过8Gyγ射线照射24h后，提取肝细胞内的蛋白进行Western blot检测。结果显示与受照小鼠肝脏内凋亡相关蛋白表达相似，富H2溶液组中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显上调，而促凋亡蛋白Bax的表达量显著下调。3.4富H2溶液对受照小鼠肝脏内凋亡相关蛋白表达的影响：小鼠6.5Gy γ射线照射24h后，提取小鼠肝脏内的蛋白进行Western blot检测，结果显示，与单纯照射组相比，富H2溶液组中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量明显上调，而促凋亡蛋白Bax的表达量显著下调。3.5分子氢在小鼠肝脏内的浓度变化：腹腔注射富H2溶液后，用氢电极分别在0、5、10、15分钟时检测小鼠肝脏内的分子氢的浓度变化。结果显示，5分钟时分子氢在肝脏内的浓度达到最大，而15分钟时基本回复到基础值。讨论与分析：辐射相关肝损伤一直是一个亟待解决的问题，辐射所致肝毒性及后发一些相关疾病也成为了放射治疗应用于肝癌治疗过程中的主要障碍。辐射对机体的损伤主要分为直接损伤和间接损伤，而间接损伤占辐射损伤的70%-80%左右，同时也是引发辐射相关肝脏疾病的主要原因，因此通过清除辐射产生的自由基，可以有效的减轻辐射对机体的损伤。近年发现，氢气具有选择性清除羟自由基的能力，本实验室也在之前的研究中证明了富H2溶液具有良好的辐射防护作用，对小鼠的造血系统及小肠组织起到了明显的保护作用，且无毒副作用。在实验中发现富H2溶液能够有效的清除照射后L-02细胞中由于辐射产生的羟自由基，并提高照后L-02细胞的存活率，以及降低L-02细胞的凋亡。我们还发现富H2溶液对小鼠肝脏也具有很强的辐射防护效应，照前给小鼠腹腔注射富H2溶液能够改善小鼠的肝功能，保护小鼠肝脏的形态完好，减少正常肝细胞的凋亡。我们进一步对富H2溶液的辐射防护机制进行了初步研究，发现照前给予富H2溶液能有效降低照后小鼠肝脏内8-OHdG及PC的浓度从而减少氧化损伤，并能减轻由于氧化损伤引发的相关凋亡蛋白表达机制从而减少正常肝细胞的死亡。结论：富H2溶液对人肝脏细胞及小鼠肝脏的辐射损伤具有较好的防护作用，其机理与清除辐射产生的自由基和减轻由此引起的生物分子氧化损伤有关。由于氢气已被证明对人体无毒无害，因此富H2溶液在辐射损伤防护领域将有很好的应用前景。