【研究背景】血管生成是一个涉及内皮细胞（ECS）、平滑肌细胞（SMC）协同作用的多步骤多环节的过程。在VEGF等促血管生成因子的刺激下，血管内皮细胞从原有的血管萌出，不断增殖，迁移，分化以形成新的血管，随后募集周细胞包被新生血管，促进其成熟。Notch信号通路在血管生成中具有重要的作用，可通过调节血管内皮细胞的增殖，迁移或者分化以及平滑肌细胞的募集进而调控血管生成。如以γ-分泌酶抑制剂（GSI）阻断Notch信号通路或者在血管内皮细胞上敲除Notch的配体DLL4或者Notch1均可导致血管生成中tip细胞数量增加。另外，Notch信号途径也被报道在维持血管内环境稳态方面发挥重要的作用。然而，Notch信号如何调控新生血管形成的分子机制，尚未完全清楚。目前，大量文献报道，活性氧簇（Reactive oxygen species, ROS）主要包括过氧化氢和超氧阴离子等活性氧分子，它在细胞的生理和病理状态下均发挥重要作用。低浓度的ROS可作为信号分子，介导内皮细胞增殖和迁移，并调节体内血管生成。NADPH氧化酶家族（NOX）是由多个亚基组成的酶复合体，其主要包括:位于胞膜的细胞色素b558（gp91phox和p22phox）和位于胞浆的p67phox、p47phox、及Rac（小GTP结合蛋白）等五个亚基。p22phox和gp91phox是NOX的酶促核心成员，它们受Rac及p47phox的调节。近年来在对各种组织的研究中发现：NOX共有5种同源家族体，分别称为NOX1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5，其分别表达在不同组织中，血管内皮细胞主要表达NOX2和NOX4。许多刺激因素，如血管内皮生长因子，缺氧和缺血再灌注（I/R），可通过激活内皮细胞NADPH氧化酶的活性，增加细胞内ROS的产生，产生的ROS可通过抑制磷酸化酪氨酸磷酸酶（PTPS）的活性，从而启动下游氧化还原反应，调控内皮细胞增殖，迁移，凋亡和血管生成过程。本实验室前期研究发现：在肝脏缺血再灌注损伤模型中，阻断Notch信号通路可以引起体外肝脏缺血再灌注损伤；肝细胞内ROS水平明显升高。提示我们：Notch信号是否参与调控血管内皮细胞ROS的生成？Notch信号调控血管内皮细胞ROS的生成的分子机制是什么？Notch信号调控ROS生成对血管内皮细胞生物学行为的影响？Notch信号调控ROS生成对血管内皮细胞生物学行为影响的分子机制是什么？这些问题的阐明将为血管生成相关性研究开辟新的领域并进一步完善血管生成分子调控的理论体系，为血管相关性疾病的预防和治疗提供理论基础。【方法】1．对传统培养方法改良，建立人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）体外培养方法，获得大量稳定高效的原代血管内皮细胞。利用流式细胞技术检测APC-CD31细胞Marker以及免疫组织化学进行Ⅷ因子染色鉴定血管内皮细胞的纯度、MTT法观察细胞生长曲线并在细胞外基质胶上鉴定内皮细胞管腔形成实验。2.体外原代培养的HUVECs，分为对照组和Notch信号阻断组，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，检测细胞内ROS水平。分别在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平，并使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞确定生理状况下，ROS的主要来源。3.体外培养人原代HUVECs被分为六组：对照组（DMSO组），单纯Notch阻断组（GSI组），Notch阻断加NADPH氧化酶阻断组（GSI+DPI），Notch阻断加抗氧化剂组（GSI+NAC），单纯NADPH氧化酶阻断组(DPI)和单纯抗氧化剂组(NAC)。刺激后分别用MTT法检测细胞增殖；划痕法检测细胞迁移；结晶紫染色检测细胞黏附；细胞外基质胶（Matrigel）检测管腔形成。4.体外原代培养的HUVECs，分为照组和Notch信号阻断组，经刺激48h，RIPA裂解收取蛋白，定量并变性后，蛋白印记法（Western-Blots）检测HUVECs相关蛋白表达水平变化。【结果】1．采用改良体外培养HUVECs培养方法，获得大量稳定血管内皮细胞，应用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基（ECM）培养细胞，MTT法观察细胞生长曲线表明：细胞生长旺盛2-3d生长最快，4-6d可融合。利用流式细胞技术进行APC-CD31细胞Marker以及免疫组织化学进行Ⅷ因子染色鉴定，血管内皮细胞的纯度高达99.56%。2.体外原代培养的HUVECs，经GSI阻断Notch信号后，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，结果表明：在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平明显升高。随后使用相关的抑制剂作用血管内皮细胞后，利用DCFH-DA荧光探针结合用流式细胞技术，结果发现：生理状况下，ROS的主要来源于细胞膜上的NADPH氧化酶。3.体外培养的HUVECs，各组经刺激后分别用MTT法检测细胞增殖、划痕法检测细胞迁移、检测黏附及体外管腔形成。结果显示：阻断Notch信号通路后，HUVECs增殖明显增加；细胞迁移速度加快；黏附以及管腔生成增加；利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后，细胞增殖明显减慢；划痕法检测细胞迁移；细胞迁移，黏附及管腔形成实验均得到相似结果。4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后，蛋白印记法（Western-Blots）检测HUVECs相关蛋白结果显示：阻断Notch后，NOX4蛋白含量明显增加；VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加；SOD1蛋白水平未见明显变化。【结论】1．采用改良外培养HUVECs培养方法，获得大量稳定高纯度的HUVECs，为后续实验提供充足的细胞来源。2.体外培养HUVECs，经GSI阻断Notch信号后，在生理状态下以及缺血再灌注条件下细胞内活性氧（ROS）水平明显升高；使用相关的抑制剂后，证实血管内皮细胞内ROS的主要来源来细胞膜上的NADPH氧化酶。3.体外培养HUVECs，经GSI阻断Notch信号及各组经刺激后， HUVECs细胞增殖、迁移、黏附及管腔生成明显增加；利用ROS清除剂以及NOX抑制剂后，细胞增殖明显减慢；划痕法检测细胞迁移；细胞迁移，黏附及管腔形成实验均得到相似结果，说明Notch信号时通过调细胞内ROS的水平来影响血管内皮细胞生物学行为。4.体外原代培养的HUVECs经GSI阻断Notch信号48h后，Western-Blots结果显示：HUVECs经GSI阻断Notch信号后，ROS水平增加是NOX4蛋白激活引起其产生增多而非SOD1对其清除减少引起的；增加的ROS通过引起下游VEGFR2，P38及ERK的磷酸化水平增加而引起下游一系列信号反应。