论文部分内容阅读
原发性支气管肺癌(简称肺癌)，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤。世界上至少有35个国家的男性肺癌在各种癌症死因中占第一位，女性中死于肺癌的患者也仅次于乳腺癌的死亡人数。研究表明组蛋白的乙酰化状态对参与细胞增殖和分化的基因表达具有重要调控作用，因此，基于组蛋白乙酰化的治疗策略逐渐引起重视。本文主要研究了组蛋白去乙酰基酶(histone deacetylases，HDAC)抑制剂(histone deacetylases inhibitor，HDACI)TSA(Trichostatin A)对肺腺癌细胞A549的生命活动包括细胞周期及凋亡的影响，并且对特异Ⅱ型肺细胞标志——muc1基因和细胞周期调节因子cdc2基因启动子区的染色质重塑机制以及转录相关因子的结合进行了研究，为非小细胞肺癌的临床治疗提供一定的理论依据。一、TSA对肺腺癌细胞A549的细胞周期及凋亡的影响1．TSA对肺腺癌细胞A549的细胞周期的影响400nM TSA处理A549后，进行流式细胞仪检测结果显示：TSA可以引起A549细胞周期在G1期和G2／M期产生阻滞，以G2／M期阻滞更为显著。同时发现TSA也抑制G2／M期细胞周期相关因子cdc2，cdc25c以及cyclinB2的mRNA的表达，促进G1期细胞周期相关因子p21 mRNA的表达。2．TSA对肺腺癌细胞A549凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示400nM TSA处理16小时起A549细胞开始出现凋亡，随着TSA处理时间的延长，凋亡程度逐渐加重；同时western blotting结果显示400nM TSA处理16小时起，PARP开始出现断裂，随着时间的延长PARP断裂程度逐渐加重。二、TSA与p53对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响1．TSA对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响：构建带有人2.4kb的muc1基因上游调控区序列以及cdc2基因启动子区的-758／+61的CAT报告基因质粒pREP4m-muc1-2.4k与pREP4m-cdc2-CAT。将含有报告基因表达质粒pREP4m-muc1-2.4k和pREP4m-cdc2-CAT以及内参照质粒pM-CAT瞬时共转染A549细胞之后加入TSA进行诱导处理，启动子活性分析结果表明：TSA可以抑制muc1和cdc2基因的启动子活性。将muc1基因上游调控区进行删切，构建不同长度(4k、1.6k、298bp、724bp)启动子序列驱动的报告基因质粒，启动子活性分析结果表明：TSA对muc1基因转录活性的抑制可能通过muc1基因启动子区-724上游的调控区介导。2．p53对muc1基因及cdc2基因启动子活性的影响：p53表达质粒与pREP4m-muc1-2.4k和pREP4m-cdc2-CAT以及pM-CAT瞬时共转染A549细胞，启动子活性分析结果表明，p53可以降低muc1基因和cdc2的启动子活性，突变的p53表达质粒可以减弱这种抑制作用，TSA处理可以加强p53对muc1基因的抑制，同时western blotting结果显示TSA处理可以促进p53的表达，提示TSA可能通过p53间接调节muc1基因的表达。将muc1基因上游调控区的两个CCAAT盒以及一个潜在的p53半位点分别进行突变后与pM-CAT瞬时共转染A549细胞，启动子活性分析结果显示，潜在的p53半位点突变后p53抑制muc1基因启动子区活性的作用急剧减弱。这些结果提示，p53可能通过p53结合位点发挥对muc1基因的调节作用。三、TSA对染色质重塑蛋白及修饰因子对muc1基因启动子活性的影响1．PCAF与p300对muc1基因启动子活性的影响：PCAF表达质粒或p300表达质粒与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞，启动子活性分析结果表明，PCAF和p300可以增强muc1基因启动子的活性。2．BRG1与BRM对muc1基因启动子活性的影响：BRG1表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞后，启动子活性分析结果表明，BRG1表达质粒抑制muc1基因启动子的活性；BRM表达质粒(或其显性负突变体)与pREP4m-muc1-2.4k和pM-CAT瞬时共转染A549细胞后，启动子活性分析结果表明，BRM表达质粒也抑制muc1基因启动子的活性，并呈剂量依赖性。BRM显性负突变体可逆转BRM对muc1基因基因的抑制，这些结果均表明BRM在TSA对muc1基因启动子活性的调节过程中发挥重要作用。四、TSA对染色质重塑蛋白及修饰因子与muc1基因及G2／M细胞周期调节基因上游调控区结合的影响为了进一步研究p53及染色质调整蛋白及修饰因子对muc1基因及cdc2基因表达的影响，应用染色质免疫沉淀技术对p300，PCAF，mSin3A，p53，Ac-p53，Brm，H3K9-Ac以及H3K14-Ac抗体在TSA处理A549细胞前后，与muc1基因及cdc2基因启动子区的结合状况进行了研究，ChIP实验结果表明：1．PCAF在TSA诱导A549细胞后24h从muc1基因启动子负调控区脱离，而p300无论TSA是否诱导，均可结合于muc1基因启动子上；此外，在TSA处理后，p53与K373-382乙酰化的p53才结合于muc1基因启动子上，并且结合于基因启动子区的mSin3A及Brm显著增加。但是无论TSA处理与否，muc1基因启动子负调控区的H3K9以及H3K14均呈乙酰化状态。2．在cdc2，cdc25c与cyclinB2基因启动子区，无论TSA处理与否，p53一直结合于它们启动子区的CCAAT盒；TSA处理后，结合于这些基因的启动子上K373-382乙酰化的p53和mSin3A增加，p300降低；无论TSA处理与否，PCAF一直结合于cdc2与cdc25c基因的启动子区，而无PCAF结合于cyclinB2基因启动子区；同时结合于这些基因启动子区的H3K14与H3K9乙酰化发生不同程度降低。另外，免疫共沉淀实验结果显示，TSA可使结合于brm的mSin3A蛋白量略有增加，而减弱PCAF与mSin3A之间的相互作用。综合以上结果，提出如下推测：TSA处理A549细胞后，促使PCAF与p300乙酰化p53，乙酰化后的p53结合于muc1基因的启动子区，而且TSA可能诱导SWI／SNF染色质重塑复合物募集mSin3A到muc1基因启动子，从而使该基因启动子区的染色质发生重塑，调节muc1基因的表达。