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生防枯草芽胞杆菌NCD-2菌株是微生物杀菌剂“10亿芽胞/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂”的主要成分,对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等病原菌引起的作物病害具有良好的防治效果。前期研究表明,NCD-2菌株主要通过产生脂肽类抑菌物质——丰产素(fengycin)和有效的根际定殖而达到理想的防病效果,而该菌株的根际定殖能力与其生物膜形成相关。为了进一步明确NCD-2菌株防治土传病害的作用机制,本研究采用分子遗传学技术、基因表达谱芯片技术(DNA microarray)和微生物表型芯片技术(Phenotype Microassays,PM)对NCD-2菌株丰产素合成和生物膜形成相关基因进行了功能分析和调控研究,主要结果如下:1.明确Com A是NCD-2菌株丰产素合成和生物膜的形成过程中重要的调控因子为明确群体感应系统在NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用,克隆获得了群体感应系统基因com Q、com X、com P和com A的全长序列(Gene Bank登录号分别为GQ924946、GQ924947、GQ924948和GQ924945)。通过同源重组技术对群体感应系统中的调控因子Com A基因进行定位缺失突变,分别比较了NCD-2菌株和com A突变子在胞外酶合成、抑菌活性、丰产素合成以及生物膜形成上的差异,并进一步利用实时荧光定量PCR技术比较了二者生物膜基质编码基因eps A和tas A的表达情况。结果表明,同NCD-2菌株野生型相比,com A缺失突变子在胞外蛋白酶和纤维素酶的合成能力、对番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)的抑菌活性、丰产素的合成量和生物膜形成能力上均明显下降,且生物膜基质编码基因tas A的表达量下降了70%,而eps的表达量变化不明显。以上结果表明Com A是NCD-2菌株丰产素合成和生物膜形成中的重要调控因子。2.明确Deg Q是NCD-2菌株丰产素产生和生物膜的形成过程中重要的调控因子为明确Deg Q在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用,克隆获得了deg Q基因(Gene Bank登录号GQ924949),该基因全长141 bp,通过同源重组技术和互补技术对deg Q进行定位缺失突变和功能互补。分别比较了NCD-2菌株野生型及其衍生菌株在胞外酶合成、抑菌活性、丰产素产生及生物膜形成上的差异,并进一步利用实时荧光定量PCR技术比较了NCD-2菌株野生型及其衍生菌株丰产素合成酶编码基因fen A的表达情况。结果表明,同NCD-2菌株野生型相比,deg Q基因缺失突变子在胞外蛋白酶和纤维素酶的合成能力和丰产素的合成量均明显下降,且丰产素合成酶编码基因fen A的表达量降低至原来的1/2,对番茄灰霉菌的抑菌活性和生物膜形成能力上均显著下降。而互补菌株的这些性状全部恢复至野生型水平。以上结果表明Deg Q是NCD-2菌株脂肽抗生素和生物膜形成中的重要调控因子。3.明确Deg Q影响NCD-2菌株的抗渗透压能力和氨基酸脱羧酶的产生能力利用表型芯片(Phenotype Microarray,PM)技术分别测定了NCD-2菌株野生型和deg Q突变子在利用碳源代谢、氮源(氨基酸和短肽)代谢、磷源代谢、硫源代谢、生物合成途径、抗渗透压、不同p H值的底物条件下的细胞表型差异。结果表明,NCD-2菌株和突变子在碳源代谢、氮源代谢、硫源代谢、磷源代谢及生物合成途径方面差异不大。在底物为p H 5.2 100 m M苯甲酸钠时,deg Q突变子表现出的渗透压抗性明显强于NCD-2菌株。NCD-2菌株和deg Q突变子在p H 4.5下的产氨基酸脱羧酶方面表现出明显差异,当底物为L-亮氨酸,NCD-2菌株野生型能够产生L-亮氨酸脱羧酶对底物进行脱羧反应,而deg Q突变后,突变子丧失了对L-亮氨酸的脱羧能力。NCD-2菌株不能产生L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-正亮氨酸脱羧酶,而deg Q突变后,突变子增强了L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-正亮氨酸脱羧酶活性,表明Deg Q可能正调控L-亮氨酸脱羧酶,负调控L-异亮氨酸、L-色氨酸、L-正亮氨酸脱羧酶的合成。4.明确ywb B基因正调控NCD-2菌株生物膜形成和胞外基质编码基因的表达前期试验证明突变ywb B后NCD-2菌株丧失了生物膜形成能力。利用RT-q PCR(Reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-q PCR)技术测定生物膜状态下NCD-2菌株和ywb B突变子tas A和eps A基因的表达,结果发现ywb B突变子中的tas A和eps A基因的表达量相对于NCD-2菌株野生型的表达量分别下降了64%和85%,表明ywb B基因正调控tas A和eps A基因的表达。5.基因芯片技术分析获得NCD-2菌株中受ywb B调控并与生物膜形成相关的基因利用基因芯片技术对产生生物膜状态下的NCD-2菌株野生型和ywb B突变子基因组中4206个基因进行基因差异表达分析,得到37个与生物膜形成相关并受ywb B上调的基因,42个与生物膜形成相关并受ywb B下调的基因。利用RT-q PCR技术测定了其中5个基因tas A(编码芽胞蛋白)、eps A(编码胞外多糖)、ssp B(编码酸溶性芽胞蛋白)、sip W(编码Ⅰ型信号肽酶W)、spo IIAA(编码抗-抗δF因子)、cot JC(编码芽胞衣多肽组分)在NCD-2菌株野生型和ywb B突变子中的表达量,结果发现,相对于在NCD-2菌株中的表达量,tas A、ssp B、sip W、spo IIAA和cot JC基因在突变子中的表达量均显著下降了64%、99%、77%、79%、97%,与基因芯片测定的结果一致。6.明确3个受ywb B调控并与生物膜形成相关基因spo IIAA、sip W和cot JC的功能通过对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株全基因组进行序列分析,克隆得到sip W、spo IIAA、cot JC基因全序列,大小分别为573 bp、354 bp、570 bp。利用同源重组技术对spo IIAA、sip W和cot JC基因进行定位缺失突变。分别比较了NCD-2菌株野生型和突变子在生物膜形成、抑菌活性、根际定殖上的差异,结果表明sip W和spo IIAA基因突变子在生物膜形成、抑菌活性、根际定殖能力以及对棉花立枯病的防效方面同NCD-2菌株野生型相比均明显下降,而cot JC基因突变子的上述性状同NCD-2菌株野生型相比差别均不明显。由此得出以下结论:(1)群体感应系统调控基因com A及其多效调控基因deg Q在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株丰产素合成、生物膜形成、胞外酶产生等方面具有重要功能;(2)deg Q基因对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株的抗渗透压和氨基酸脱羧酶活性方面有重要影响;(3)ywb B基因在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株正调控生物膜形成以及tas A、eps A、ssp B、sip W、spo IIAA、cot JC基因的表达;(4)sip W、spo IIAA在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成、抑菌能力、根际定殖能力等方面具有重要影响。