论文部分内容阅读
研究背景:国际癌症研究机构的最新资料表明,胃癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一,据《Cancer Statistics in China,2015》统计结果显示,胃癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中位列第二。在我国,2015年新增胃癌病例67.9万人,因胃癌死亡人数为49.8万人,胃癌的患病率和死亡率均是世界平均水平的两倍多。目前胃癌的诊断还缺乏特异性标志物。本实验通过比较健康志愿者(Healthy volunteers,HV),萎缩性胃炎(Atrophic gastritis patients,AG)和胃癌患者(Gastric cancer patients,GC)的唾液糖蛋白糖型差异,评估唾液糖蛋白糖型作为胃癌诊断潜在标志物的可行性。实验方法:本实验总计收集了 201例唾液样本,分为实验组与验证组。首先利用凝集素芯片分析了实验组124例唾液样本(30例HV,30例AG,64例GC),比较HV,AG和GC之间的唾液糖蛋白糖型差异。并且利用唾液芯片和凝集素印迹实验对凝集素芯片结果进行验证。其次,对实验组凝集素芯片数据进行逐步逻辑回归分析,构建AG和GC诊断模型(Model AG和Model GC),利用验证组(30例HV,24例AG,23例GC)的凝集素芯片数据对模型进行评估。最后,利用凝集素AAL-磁粒复合体分离AAL识别的岩藻糖基化糖蛋白,通过PNGaseF酶切法和次氯酸钠(NaClO)氧化法分别释放糖蛋白上的N-糖链与O-糖链,纯化和除盐后用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定糖链的完整结构。实验结果:凝集素芯片结果显示有15种凝集素识别的糖链结构在HV、AG和GC之间存在显著差异。相较于HV,识别α-D-Man和Fuccα-1,6GlcNAc糖链结构的PSA以及识别 Bisecting GlcNAc 和 Complex-type N-glycan with outer Gal 糖链结构的 PHA-E的归一化后荧光强度(Normalized fluorescent intensities,NFIs)在 AG 和 GC 中低表达(p<0.05);而识别 Galβ-1,4GlcNAc(type Ⅱ)和 Galβ 1-3GlcNAc(type Ⅰ)糖链结构的 ECA、识别 High-Mannose,Manα1-3Man 和 Manα1-6Man 糖链结构的 HHL、识别Ga1β1-3GalNAcα-Ser/Thr(T)糖链结构的 PNA、识别 Galα1-3(Fucα1-2)Gal(blood group B antigen)糖链结构的EEL、识别Ga1β1-3GalNAc和GalNAc糖链结构的MPL以及识别αGalNAc和αGal糖链结构的GSL-I的NFIs在AG和GC中高表达(p<0.05);识别 β-D-GlcNA,(GlcNAcβ1-4)n 和 Ga1β1-4GlcNAc 糖链结构的 DSA、识别(GlcNAc)n和 High Mannose-type N-glycan 糖链结构的 LEL 的 NFIs 在 AG 中显著上调(p<0.01);识别 Fucα1-2Ga1β1-4GlcNAc 和 Fucα1-3(Galβ1-4)GlcNAc 糖链结构的 LTL 的 NFIs在 AG 中显著下调(p<0.01);识别 terminal GalNAc,GalNAcα-Ser/Thr(Tn)和GalNAcα1-3Gal 识别的 VVA,识别 α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal 以及与 Galα-1,6Glc的 BS-I,识别 α-or β-linked terminal GalNAc,(GalNAc)n 和 GalNAcα1-3Gal 的 SBA 的NFIs 在 GC 中显著上调(P<0.01);识别 Fucoα1-6GlcNAc(core fucose)和Fucα1-3(Ga1β1-4)GlcNAc 的 AAL 的 NFIs 在 GC 中显著下调(p≤0.001)。利用唾液芯片以及凝集素印迹技术验证凝集素芯片结果,唾液芯片与凝集素印迹实验结果均与凝集素芯片的结果一致。从整体糖链水平着手,聚类分析以及主成分分析共同显示了唾液糖蛋白糖型能够用于区分HV、AG和GC。Model GC诊断模型在验证组中达到的较好的诊断效果(AUC:0.89,敏感度:0.96,特异性:0.80),能够成功区分出23例GC中的22例,24例AG中的19例,30例HV中的24例;Model AG诊断模型同样获得了较好的诊断效果(AUC:0.83,敏感度:0.92,特异性:0.72),能够成功区分出24例AG中的22例,23例GC中的13例,30例HV中的25例。此外,利用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定了凝集素AAL分离的糖蛋白上糖链的完整结构,结果显示了 AAL分离的糖蛋白的岩藻糖基化糖链类型在HV、AG和GC中存在显著的差异,岩藻糖基化O-糖链种类的数量在胃癌的发展过程中呈现出减少的趋势。值的关注的是,m/z 1776.629是HV和AG质谱图中最高强度的糖链峰(岩藻糖基化),在GC中则成为一个低强度的糖链峰。而GC中2个最高强度的糖链峰m/z 1730.636和1752.610指示为同一种糖链(二者离子不同,分别为[M+H]+和[M+Na]+),在HV和AG中则是中等丰度的糖链。由此可见,唾液糖蛋白糖型具有成为胃癌诊断标志物的潜能。