研究背景与目的颈椎后纵韧带骨化症(Ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是一种严重的退行性脊柱疾病,病理特点为异常骨化的颈椎后纵韧带压迫脊髓和神经根,进而导致神经功能障碍,主要症状表现为四肢及躯干感觉、运动功能障碍,括约肌功能障碍以及颈肩部僵硬疼痛,严重的韧带骨化可以导致四肢瘫痪和大小便失禁,严重降低患者的生活质量。流行病学研究表明OPLL好发于男性,平均发病年龄为50岁,并且发病具有明显的种族差异,东亚地区人群发病率较高,调查数据显示不同种族人群中发病率为0.1%-4.3%。目前,学者认为OPLL是一种遗传因素和环境因素共同作用所致的疾病,但是具体的病因尚不清楚。大多OPLL患者早期无明显临床症状或仅表现为手麻、颈肩部不适等轻微症状,未能引起足够重视。由于骨化物的增长或遭受颈椎外伤,患者会出现颈脊髓病或神经根病的症状而就诊,此时病情往往较重,预后不佳。因此,OPLL的早期诊断、早期治疗对疾病预后有很大影响。临床中OPLL的诊断主要根据患者的症状、体征和影像学检查结果,虽然高分辨率CT检查是诊断OPLL的金标准,但是CT检查存在辐射损伤、设备昂贵、检查费高等诸多不足,不利于OPLL早期筛查。因此,寻求有效、简单、安全、经济的方法来早期筛查和诊断OPLL是亟需解决的问题。此外,对于有严重颈椎病症状的OPLL患者,学者普遍认为外科手术是唯一有效的治疗方式,但是当OPLL患者没有症状或只有轻微颈椎病症状的时候,是否应该进行手术治疗一直存在争论。因此,探索OPLL预后因素对于指导临床治疗,合理选择手术时机,评估疾病预后具有重要的意义。目前,大量研究发现多个基因在OPLL的病因和发病机制中发挥作用。表观遗传是基因表达调控的重要方式,它在不改变DNA序列的情况下,可以改变基因的表达,其中就包括miRNA和DNA甲基化。miRNA是一类长度为18-22nt的非编码单链RNA,可以在转录后水平上调控基因表达,并且在肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、骨关节炎等疾病的发病中发挥重要作用。DNA甲基化是指一个甲基基团和胞嘧啶第5位碳原子共价结合,从而形成5-甲基胞嘧啶。在哺乳动物中,DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸,通过影响转录因子和染色质结合来调控基因转录。研究表明DNA甲基化在肿瘤、衰老、糖尿病、自身免疫性疾病、心血管疾病等多种疾病的发病和进展中发挥作用。这些研究报道提示我们,OPLL患者中可能存在异常表达的miRNA和DNA甲基化,它们可能通过调控基因的表达来影响OPLL的发生和发展。因此,我们设计了下列实验来探索miRNA和DNA甲基化与OPLL预后之间的关系。第一部分:OPLL外周血miRNAs的高通量筛查方法:(1)采集接受手术治疗的OPLL患者与非OPLL患者后纵韧带组织和外周血;(2)利用高通量测序技术对组织和外周血样本进行miRNA测序;(3)生物信息学分析,筛选出OPLL中显著差异表达的miRNA;(4)利用real-time PCR对OPLL差异表达miR-218进行验证。结果:(1)在OPLL后纵韧带组织中,miR-10a-5p,miR-10a-3p,miR-563,miR-885-5p和miR-210-3p表达显著上调;miR-199b-5p,miR-196b-5p,miR-129-3p,miR-218-3p和miR-212-3p表达显著下调。(2)在OPLL外周血中,miR-484和miR-4731-5p表达显著上调;miR-218-5p和miR-9-3p表达显著下调。(3)两次实验结果取交集,只有miR-218在OPLL组织和外周血中都存在显著差异表达。(4)通过real-time PCR验证得出OPLL特异性miR-218表达显著下调。结论:在OPLL患者后纵韧带组织和外周血中,miR-218表达存在显著差异。与对照组相比,OPLL患者外周血中miR-218表达显著下调,低表达的miR-218可能与OPLL发病和进展有关。第二部分:OPLL外周血DNA甲基化的高通量筛查方法:(1)采集20例OPLL患者和20例健康正常人的外周血;(2)提取外周血细胞中DNA;(3)构建CpG甲基化文库;(4)CpG精准甲基化高通量测序;(5)数据分析找到差异DNA甲基化区域(DMR),并对其进行功能注释分析。结果:(1)两组甲基化数据分析得到一共有250640个DMR,从中筛选出197个显著的DMR。(2)DMR注释找到197个所属基因,GO分析筛选出3个与骨骼发育相关的基因BMP5,BMPR1B和FGFR1,并且在OPLL组中BMP5和BMPR1B甲基化水平显著降低,而FGFR1甲基化水平显著增高。结论:BMP5和BMPR1B基因低甲基化和FGFR1基因高甲基化可能通过调控基因表达在OPLL的发病和进展中发挥作用。第三部分:OPLL外周血miRNA与DNA甲基化与疾病预后的相关性分析方法:(1)采集52例接受手术治疗的OPLL患者术前外周血;(2)对患者术前和术后1年随访时的神经功能进行评估;(3)利用高通量测序技术检测外周血miR-218的表达水平;(4)利用CpG精准甲基化测序技术检测外周血BMP5,BMPR1B和FGFR1甲基化水平;(5)分析外周血核酸标志物表达水平与术后神经功能恢复之间的相关性。结果:(1)神经功能恢复较好组患者术前外周血miR-218表达水平显著高于恢复较差组,而FGFR1甲基化水平显著低于恢复较差组;(2)多变量logistic回归分析得出miR-218表达水平是OPLL患者术后预后不良的保护因素,而FGFR1甲基化水平是预后不良的危险因素。结论:OPLL术前外周血miR-218与FGFR1甲基化表达水平与患者术后神经功能恢复有关,有可能成为OPLL潜在的预后评估的生物标志物。总结颈椎OPLL是一种严重的退行性脊柱疾病,发病机制复杂,病因尚不明确。目前,OPLL疾病诊断和预后评估主要依据患者的症状和影像学检查结果,还未发现有效的体液检验指标可以用于疾病的诊疗。作为表观遗传的重要机制,miRNA和DNA甲基化在多种疾病的发病和进展中发挥重要作用,可以用于疾病的诊断、预后评估和靶向治疗,但是miRNA和DNA甲基化与OPLL疾病预后的相关性研究还未见报道。我们应用高通量测序技术在OPLL患者组织和外周血中发现miR-218表达显著下调,可能与OPLL发病有关。通过对OPLL患者外周血CpG精准甲基化测序,我们得出BMP5和BMPR1B基因甲基化水平降低,而FGFR1基因甲基化水平增高,差异表达的DNA甲基化可能通过影响骨化形成在OPLL发病中发挥作用。此外,通过分析OPLL术前外周血核酸标志物表达水平与患者术后神经功能恢复的相关性,我们发现miR-218表达水平是OPLL患者术后预后不良的保护因素,而FGFR1甲基化水平是预后不良的危险因素,表明miR-218和FGFR1甲基化表达水平可作为潜在的OPLL预后评估的生物标志物。