砷是广泛存在于自然界的一种类金属元素。随着经济发展和人类行为对环境影响的加剧,矿山开发、污水灌溉、农药使用等导致排入环境中的砷污染物大量增加,造成十分严重的环境问题。砷元素所具有的化学结构使其能够在环境中和生物体中以不同的形态存在,主要包括三价砷[As(Ⅲ)]、五价砷[As(Ⅴ)]、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)等。由于不同的砷形态彼此之间毒性差异较大,传统的仅通过测定环境样品中的总砷进行环境质量评价和风险评估的方法缺乏科学性,不能给出有关毒性的准确信息,因此有必要建立能够高效分离测定环境样品中多种形态砷化合物的方法,并在此基础上研究不同形态砷对生物的毒性特征和致毒机理。土壤是生态系统的重要组成部分,同时也是排入环境中的砷污染物大量积累的环境介质之一。土壤中不同形态的砷既可通过各种途径进入动植物体内,产生毒性效应,亦可通过食物链传递,对人体健康造成威胁。传统的土壤污染检测和风险评估方法没有针对不同形态砷的生态毒性进行区分,无法反映不同形态砷的真实生态风险。因此,有必要研究土壤主要形态砷对典型指示生物的生态毒性特征和致毒机理,从而为基于环境中不同形态砷的生态风险评价,建立适于指示土壤不同形态砷水平的评价指标体系和生物评价模式,以及实施区分砷形态的环境污染控制和管理提供科学依据。本论文针对环境中存在的四种主要形态砷,As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA,在前人研究的基础上,分别以改进提取测定技术和研究在线自动测定技术为主要突破点,建立了两种新的砷形态分析方法,分别为衍生-超临界流体萃取-气相色谱法和氢化物发生-冷阱捕获-原子吸收法(HG-CT-AAS)。前者实现了衍生-超临界流体萃取(SFE)和衍生-气相色谱法(GC)的结合,简化了砷形态分析的操作步骤,提高了分析效率;后者在原有的HG-CT-AAS分析系统中,加入了自动在线预还原装置并进行优化,实现了预还原过程与HG-CT-AAS的联合自动运行分析。在此基础上,以国家和国际标准推荐的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)作为典型指示生物,研究了上述四种形态砷的急性毒性和亚慢性毒性,以及在蚯蚓体内的生物富集和转化过程;通过测定分析蚯蚓体内7种氧化应激生物标志物(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽硫转移酶、谷胱甘肽还原酶、还原型谷胱甘肽、脂质过氧化水平)、金属硫蛋白(MTs)和溶酶体膜稳定性(LMS)等分子水平和亚细胞水平生物标志物的响应特征,计算综合生物标志物响应指数(IBR),以及与化学分析结果结合分析剂量-效应关系,研究不同形态砷对赤子爱胜蚓的生态毒性特征和致毒机理。主要研究内容和结论如下。(1)结合衍生-SFE技术和衍生-GC技术,建立了一种衍生-SFE与GC联用的分析方法。该方法能够在SFE过程中发生衍生反应,得到样品中不同形态砷的衍生物,后者可直接注入GC进行分离测定,得到样品中的无机砷、MMA和DMA含量。优化了衍生-SFE萃取的各项参数,最佳萃取条件为:30 Mpa,100℃,10 min静态萃取和25 min动态萃取,2.0 mL min-1超临界CO2流速,加入5%(v/v)甲醇作为超临界流体的改性剂,并加入一定量含有Triton X-100的表面活性剂;比较了巯基乙酸乙酯(TGE)和巯基乙酸甲酯(TGM)两种衍生试剂的衍生效果,确定TGE作为衍生试剂时能够得到较好的分析结果;在最优条件下,无机砷、MMA和DMA的检出限分别为1.2、0.3和0.15 mg kg-1。该方法具有分析速度快、选择性好、准确度高、检出限低等特点,能够直接提取并检测固体样品中不同形态的砷,可效减少有机试剂的消耗和有害化学废物的产生量。(2)探索优化HG-CT-AAS方法进行砷形态分析时的样品预还原过程,实现了 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的准确定量分析。首先通过优化传统离线预还原方法所用的还原剂种类和浓度,证明1%(m/v)巯基乙酸(TGA)为还原剂时能在较短时间内完成As(Ⅴ)的预还原过程;在此基础上建立了一套在线预还原系统,与HG-CT-AAS的管路系统相连接。优化后的实验结果显示,在线预还原系统中加装空气分隔装置,可以有效保证还原反应体系中各组分浓度的稳定性,从而保证还原效果和砷形态分析结果准确可靠。利用优化后的方法建立了四种形态砷的标准曲线,得到As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA的检出限分别为152 ngL-1、146 ngL-1、65ngL-1、52 ngL-1,实现了痕量水平的砷形态分析。该方法具有分析速度快、准确度高、检出限低等特点,并通过在线预还原过程实现了自动化操作,既减少了人为操作的不确定性,同时也缩短了样品分析时间,具有很好的应用价值。(3)选取土壤中的四种主要的形态砷,As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA,以赤子爱胜蚓为指示生物,参照国家和国际标准方法展开四种形态砷对赤子爱胜蚓的急性毒性实验,得到As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA对赤子爱胜蚓的14 d LC50值分别为293.3、352.4、3425.1和3730.3 mg kg-1,大小排序与不同形态砷的毒性大小顺序相一致。选择四种形态砷14 dLC50的十分之一,作为为期64天的亚慢性毒性实验的暴露浓度,结果显示暴露于无机砷的蚯蚓生物个体出现明显的生物富集现象,而暴露于有机砷的个体未发生生物富集。研究了不同形态砷在蚯蚓体内的生物转化规律,发现生物体内砷转化过程模型为,生物体将进入体内的砷由高毒性的无机砷逐步转化为低毒性的有机砷,最终转化为复杂的无毒砷化合物排出体外,从而实现对砷的解毒和代谢。但研究中还发现了与上述过程相反的有机砷去甲基化的过程,导致生成了毒性较大的无机砷,逐渐积累并对生物体产生危害,这是MMA和DMA具有间接生物毒性的机制之一。(4)对赤子爱胜蚓展开为期64天的亚慢性毒性实验的同时,测定了蚯蚓体内的7种氧化应激生物标志物和MTs的活性水平变化特征,发现暴露于As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的实验组的多种生物标志物响应趋势彼此相似,而暴露于MMA和DMA的实验组的多种生物标志物响应趋势也彼此相似;前者的生物标志物变化幅度大于后者,无机砷污染对赤子爱胜蚓的生物毒性影响大于有机砷。实验后期,暴露于无机砷的生物个体逐渐出现了氧化损伤,As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的污染压力逐渐超出了抗氧化防御系统的调控能力;而暴露于有机砷的生物个体未出现氧化损伤,其抗氧化防御系统有效发挥了作用。应用IBR指数将8种生物标志物的响应整合计算,四种形态砷的生物毒性大小排序为As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA和DMA,两种有机砷彼此之间的毒性差异较小。在高浓度有机砷污染的实验组中,MMA和DMA的生物富集没有引起生物标志物的显著变化,而MMA和DMA的去甲基化过程逐渐造成无机砷的积累,同时引起了蚯蚓的生物标志物响应,两者之间具有很好的相关性;在无机砷实验组中,生物标志物变化趋势也与体内无机砷的变化趋势相一致。研究发现砷的致毒机制为:无机砷可通过诱导生成氧化自由基(ROS),破坏生物体内的ROS平衡,对生物体产生氧化损伤毒性;有机砷可通过去甲基化生成无机砷,逐渐积累并按照与无机砷相同的途径致毒。因此在环境质量评价或生态风险评价中,应当区分环境中或生物体内不同形态的砷,包括本身直接毒性较低的有机砷,以得到更为合理的环境质量评价或风险评估结果。(5)选取土壤中的四种主要的形态砷,As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA和DMA,以赤子爱胜蚓为实验生物,测定为期70天的暴露实验周期中蚯蚓体内溶酶体膜稳定性的变化特征,展开四种形态砷对赤子爱胜蚓的亚慢性毒性实验。实验同时对蚯蚓体内的不同形态砷和总砷进行分析,得到的蚯蚓体内不同形态砷的生物转化规律与第四章的研究结论相同。四个实验组蚯蚓的溶酶体膜稳定性随着暴露实验的进行逐步下降,四种形态砷的毒性大小顺序为As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA。暴露于有机砷的蚯蚓体内大量富集MMA和DMA,同时未引起蚯蚓溶酶体膜的显著响应;但随着有机砷的去甲基化过程产生的无机砷不断积累,逐渐造成生物体溶酶体膜损伤,显示MMA和DMA具有间接毒性。中性红保留时间(NRRT)作为蚯蚓溶酶体膜稳定性的衡量指标,与As(Ⅲ)和As(Ⅴ)均具有显著的剂量-效应关系,且与As(Ⅲ)的相关性大于As(Ⅴ)。生物体的溶酶体膜更易于受到As(Ⅲ)的毒性影响而降低稳定性,这是As(Ⅲ)比As(Ⅴ)和有机砷具有更高生物毒性的机制之一。本论文的研究表明,对环境样品中不同形态的砷进行分析,可以提供比单独测定总砷更丰富的环境信息,这在毒性评价和生态风险评价中具有重要的实际意义和应用价值。