【摘 要】
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研究背景:人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）因其具有良好的成牙潜能、获取方便、来源广泛的特点,被认为是牙髓再生术的理想种子细胞。研究发现Mg2+转运蛋白TRPM7和CNNM4突变后导致牙本质矿化不全,低Mg2+饲料饲喂小鼠使牙本质和牙釉质矿化明显不足,表明Mg2+在牙发育矿化中起重要调控作用。本课题组前期研究发现Mg2+及其转运蛋白TRPM7诱导
【基金项目】
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国家自然科学基金（81870755）；
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研究背景:人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）因其具有良好的成牙潜能、获取方便、来源广泛的特点,被认为是牙髓再生术的理想种子细胞。研究发现Mg2+转运蛋白TRPM7和CNNM4突变后导致牙本质矿化不全,低Mg2+饲料饲喂小鼠使牙本质和牙釉质矿化明显不足,表明Mg2+在牙发育矿化中起重要调控作用。本课题组前期研究发现Mg2+及其转运蛋白TRPM7诱导人牙髓干细胞成牙本质向分化。然而,Mg2+诱导人牙髓干细胞成牙本质向分化的分子作用机制尚不清楚。本实验旨在研究富Mg2+微环境对人牙髓干细胞增殖和迁移的作用,以及对转录组表达谱和相关信号通路的影响,揭示Mg2+促进人牙髓干细胞成牙本质向分化的分子作用机制。研究方法:细胞划痕实验和CCK-8法分别检测富Mg2+微环境对人牙髓干细胞迁移能力和增殖的影响。通过高通量基因组测序分析转录组表达谱特征。对筛选出的差异基因进行GO和KEGG Pathway显著性富集分析,预测差异表达基因参与的信号通路。并通过实验进一步验证富Mg2+微环境对人牙髓干细胞ERK通路及BMP2信号通路的影响。结果:划痕实验结果显示,Mg2+浓度影响人牙髓干细胞的迁移能力,与对照组相比,培养液中加入1,5和10mM Mg2+后人牙髓干细胞的迁移能力显著增强（P<0.05）;其中5和10mM Mg2+对人牙髓干细胞迁移能力的影响无明显差异（P>0.05）。CCK-8实验结果显示Mg2+对人牙髓干细胞的增殖没有显著性影响（P>0.05）。茜素红染色结果显示,富Mg2+微环境促进人牙髓干细胞形成矿化结节,与对照组相比,1,5或10mM Mg2+组的矿化结节明显增加（P<0.05）;5和10mM Mg2+组之间无显著性差异（P>0.05）。与对照组相比,1,5或10mM Mg2+组的RUNX2,DMP-1和DSP蛋白表达显著升高（P<0.05）,表明富Mg2+微环境促进人牙髓干细胞成牙本质向分化;流式细胞术镁离子探针Mag-Fluo-4-AM检测发现,富Mg2+微环境通过增加细胞内Mg2+浓度从而促进人牙髓干细胞成牙本质向分化。TRPM7受体阻断剂2-APB（100μM）阻断Mg2+的内流,并抑制人牙髓干细胞成牙本质向分化。转录组测序发现富Mg2+微环境诱导人牙髓干细胞成牙本质向分化后,2倍以上差异表达的基因有734个,其中250个基因表达上调,484个基因表达下调;KEGG Pathway分析显示差异表达的基因参与多种信号通路,其中包括MAPK和TGF-β信号通路。与测序结果一致,进一步实验发现富Mg2+微环境激活ERK/MAPK信号通路和BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成牙本质向分化。TRPM7受体阻断剂2-APB阻断了富Mg2+微环境对ERK和BMP2通路的激活作用。ERK通路抑制剂U0126阻断了富Mg2+微环境对人牙髓干细胞成牙本质向分化的作用,并导致BMP2,BMPR1,p-Smad1/5/9蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,表明BMP2/Smads是ERK的下游通路。结论:富Mg2+微环境促进人牙髓干细胞的迁移,但对人牙髓干细胞的增殖未见明显影响;转录组基因测序检测734个差异表达的基因参与富Mg2+微环境诱导人牙髓干细胞成牙本质向分化,并且通过KEGG Pathway分析预测MAPK和TGF-β信号通路可能参与该分化过程;富Mg2+微环境通过增加细胞内Mg2+浓度激活ERK/BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成牙本质向分化。
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