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目的:土茯苓性平,味甘、淡,入脾、胃、肝经。临床常用于治疗慢性肾炎、湿疹、银屑病等免疫相关疾病,提示土茯苓可影响免疫调节。因此本课题通过亢进及抑制的免疫模型,期望揭示土茯苓免疫调节作用,及其主要物质基础,并初步探讨相关作用机制,为土茯苓研究填补空缺,也为免疫调节剂的研发积累数据。方法:1.土茯苓水提取液对环孢素免疫抑制模型影响:小鼠分为正常对照组、模型对照组、左旋咪唑阳性对照组、土茯苓水提液(低、中、高)剂量组。除正常组外,其他各组均用环孢素A溶液连续腹腔注射造模五天。成模后,土茯苓治疗组分别给予高(13.65 g·kg-1)、中(9.1 g·kg-1)、低(4.45g·kg-1)剂量土茯苓水提浓缩液,阳性对照组给予左旋咪唑溶液,正常对照组和模型组给予生理盐水,连续给药五天;在无菌条件下取小鼠脾脏,研磨成细胞浆,利用流式细胞测定仪分别考察土茯苓水提液对小鼠脾脏淋巴细胞CD3+CD4+,CD3+CD8+的影响;小鼠脾脏组织经过包埋、切片、HE染色、中性树胶封片的过程,使用光镜显微镜拍照观察土茯苓水提液对脾脏的影响;小鼠脾脏组织研磨裂解后,酶标仪570nm波长下测定OD值,计算各个样本的蛋白浓度;通过酶联免疫吸附法测定小鼠脾脏中IL-6、IL-2、IFN-γ蛋白水平,判断土茯苓水提液对免疫抑制下的脾细胞因子的影响。2.落新妇苷对血瘀银屑病模型小鼠免疫功能的影响:建立小鼠脾虚血瘀模型,除正常组外,其他小鼠冰水游泳加饥饱失常15日;此后,造模小鼠分为模型对照组、落新妇苷低(30.7 mg·kg-1)、中(61.4 mg·kg-1)、高(92.1 mg·kg-1)剂量组、甲氨蝶呤组(3.79 mg·kg-1),小鼠背部涂抹5%普萘洛尔乳剂制备血瘀-银屑病模型,造模同时给予对应治疗药物6日,正常对照和模型对照给予生理盐水;对小鼠背部皮损进行PASI评分;取材后测定小鼠脾指数、胸腺指数、脾淋巴细胞、淋巴结淋巴细胞Treg/Th1/Th17细胞数量;对小鼠皮肤病理切片进行Baker评分;酶联免疫吸附法测定小鼠皮肤炎症因子IL-6/IL-17/IFN-γ以考察落新妇苷对血瘀银屑病模型影响。3.土茯苓多糖对环磷酰胺免疫抑制模型影响:小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、土茯苓多糖低(0.3595 g·kg-1)、中(0.7189 g·kg-1)、高(1.0784 g·kg-1)剂量组,左旋咪唑组(7.58 mg·kg-1),每组6只。除了正常组,其余小鼠均环磷酰胺(40 mg·kg-1)腹腔注射造膜,造模同时给药,连续十天。造模结束后取材,测定小鼠脾指数、胸腺指数、脾脏CD3+CD19+细胞数量,考察土茯苓多糖对T、B细胞影响;通过细胞毒性试验,考察土茯苓多糖对刀豆蛋白刺激的脾淋巴细胞增殖活性的影响;通过免疫荧光法测定,考察土茯苓多糖对小鼠脾T细胞的影响。结果:1.土茯苓水提取液对环孢素免疫抑制模型影响:环孢素A造模后,小鼠体重增长缓慢,脾脏肿大,脾指数显著增加,而胸腺指数显著降低,提示造模成功。左旋咪唑组和土茯苓中剂量组显著降低小鼠的脾脏指数;除此之外,左旋咪唑组可使环孢素诱导降低的胸腺指数升高,土茯苓水提液对胸腺指数无显著影响;流式测定结果显示,土茯苓显著增加脾脏中T淋巴细胞CD4+的数量,对CD8+无显著影响;病理切片结果显示造模后脾脏被膜增厚浮肿,白髓萎缩,土茯苓可缓解脾脏白髓萎缩状态;土茯苓水提液可显著调低环孢素诱导后小鼠体内升高的IFN-γ的含量但对IL-6、IL-2无影响。2.落新妇苷对血瘀银屑病模型免疫功能影响:血瘀银屑病造模后,小鼠背部皮肤发红、增厚,部分小鼠有红斑,轻触有疼痛表现。落新妇苷中剂量、高剂量组小鼠背部皮肤皮损发红现象稍退,红斑处开始结痂脱落;落新妇苷高剂量组小鼠背部红色消退明显,效果与阳性对照组类似;PASI评分结果显示,模型组小鼠PASI评分显著升高,落新妇苷可剂量依赖性减轻皮损及降低小鼠PASI评分,降低幅度低中高分别为10.42%、17.71%、27.08%;皮肤Baker评分结果显示,落新妇苷中剂量组可显著降低Baker评分;流式细胞仪检测发现,造模后小鼠淋巴结中Treg、Th17及Th1数量显著增加,落新妇苷低、中、高剂量均显著降低Treg、Th1数量,但落新妇苷对小鼠脾脏Treg影响不大;小鼠皮损部位细胞因子检测结果显示,血瘀银屑病造模后IL-17A、IL-6、IFN-γ在银屑病皮损部位显著升高,而落新妇苷可降低皮损部位IL-17A、IL-6、IFN-γ 含量,对 IL-17A、IFN-γ 影响更显著。3.土茯苓多糖对环磷酰胺免疫抑制模型影响:模型组小鼠脾脏淋巴细胞增殖活力明显降低;多糖各给药剂量组可剂量依赖性逆转该趋势,以高剂量组效果最突出;流式检测结果显示模型组脾T、B淋巴细胞数量均降低,多糖可显著增加CD3+标记的T淋巴细胞数量,对CD19+标记的B淋巴细胞无显著影响;免疫荧光结果显示高剂量多糖组脾脏CD4+T淋巴细胞增加。结论:本课题结果表明,土茯苓水提液可促进T细胞介导的免疫作用,土茯苓多糖为其有效部位;土茯苓水提液中主要黄酮类成分落新妇苷对血瘀型银屑病模型有免疫抑制作用。落新妇苷和土茯苓多糖共同作用构成了土茯苓的免疫调节活性。