论文部分内容阅读
miRNA在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等各种生物学过程中发挥重要的调节作用。近年来,植物miRNA的鉴定及功能研究已成为热点研究领域,然而小麦作为重要的粮食作物,其miRNA功能研究却远远滞后于其他植物,这种情况亟待解决。为揭示本课题组前期研究发现的小麦穗部特异性高表达Tae-miR9677的相关功能,本研究首先通过分离克隆或人工合成分别获得Tae-miR9677前体(Tae-pre-miR9677)及其小串联模拟靶标(Tae-miR9677 STTM)序列,并将其连接在改造后的双元表达载体pCAMBIA3301上,分别获得了以Ubiqutin(UBI)启动子启动的Tae-pre-miR9677及Tae-miR9677STTM的表达载体pCAMBIA3301-Tae-pre-miR9677和pCAMBIA3301-Tae-miR9677 STTM;利用基因枪转化法和农杆菌转化法将其转入受体小麦绵阳19,获得转基因阳性小麦株系,为后续利用转基因小麦株系研究Tae-miRNA 9677的功能奠定基础工作。研究主要结果如下:(1)Tae-miR9677 STTM过表达载体构建及小麦遗传转化本实验首先设计并人工合成得到两端带有BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ酶切位点的Tae-miR9677 STTM序列,通过基因重组技术改造双元表达载体pCAMBIA3301,获得以UBI启动的Tae-miR9677 STTM表达载体pCAMBIA3301-Tae-miR9677 STTM。该载体除携带以UBI启动子控制的Tae-miR9677 STTM外,还具有一个受CAMV35S启动子控制的Bar基因,后者可以为后续利用除草剂Phosphinothricin(PPT)对愈伤组织进行筛选及再生植株的抗性鉴定提供了条件。通过基因枪转化法轰击受体小麦绵阳19幼胚愈伤共3683个,经过PPT筛选培养及分化培养,最终获得42株再生植株。利用目标序列特异性引物进行PCR检测,鉴定出阳性植株8株,转化率为0.21%;8株T0代阳性植株共收获种子27粒T0代种子。将27粒T0代种子全部萌发,成苗后获27株T1代植株,对其进行目标序列特异PCR鉴定,多次重复鉴定获得3株转基因T1代阳性植株;同时,对27株T1代植株用Basta溶液进行检测,同样,只有3株PCR检测为阳性的T1代植株对Basta溶液表现出抗性反应,这2种检测相互印证,表明本研究得到了3株T1代转基因阳性植株。(2)Tae-pre-miR9677过表达载体构建及小麦遗传转化本实验首先设计特异引物克隆得到两端带有BamHⅠ、PmlⅠ和KpnⅠ酶切位点的pre-Tae-miR9677序列,通过基因重组技术改造双元表达载体pCAMBIA3301,获得以UBI启动的Tae-pre-miR9677表达载体。该载体除携带以UBI启动子控制的Tae-pre-miR9677外,还具有一个受CAMV35S启动子控制的Bar基因,后者可以为后续利用除草剂Phosphinothricin(PPT)筛选转化再生植株提供抗性。通过改造的含有过表达载体pCAMBIA3301-Tae-pre-miR9677的农杆菌EHA105侵染受体小麦绵阳19成熟胚共1300个,经过PPT筛选,最终获得再生植株7株,利用改造得到的过表达载体pCAMBIA3301-Tae-pre-9677特异性引物进行PCR检测,鉴定出阳性植株1株;对7株转基因植株进行Basta涂抹实验,同样,只有1株PCR检测为阳性的T0代植株对Basta溶液表现出抗性反应,这2种检测相互印证,表明本研究得到了1株T0代转基因阳性植株。