第一部分:雌激素影响MC3T3-E1细胞的增殖和凋亡目的:本研究用不同浓度的β-雌二醇处理MC3T3-E1细胞,研究雌激素对成骨细胞分化的作用机制,并获得合适的处理浓度来进行下一步的RNA深度测序实验。方法:用不同浓度的β-雌二醇处理小鼠成骨MC3T3-E1细胞,DMSO为对照组,观察各组细胞的形态变化,然后利用CCK-8试剂盒来检测细胞的增殖情况,并且利用TUNEL试剂盒检测不同浓度下MC3T3-E1细胞的凋亡情况。结果:在低浓度(0.01n M和0.1n M)β-雌二醇的处理组中,细胞的形态、细胞的增殖和细胞的凋亡等细胞行为方面相对于DMSO对照组均未产生明显的差异;在1n M和10n M高浓度β-雌二醇处理组中,细胞的形态在显微镜下观察没有明显的差异,但是在细胞的凋亡和细胞的增殖方面却出现了显著的差异,尤其在10n M处理组出现了极其显著的差异。结论:10n Mβ-雌二醇为引起MC3T3-E1成骨细胞分化的最适浓度。本研究将选择10n M的处理浓度来进行下一步RNA深度测序,进一步阐述雌激素作用于成骨细胞的内在机制。第二部分RNA深度测序分析雌激素作用成骨细胞的基因和信号通路目的:为了更加深入地研究雌性激素对成骨细胞的作用机制,内在的靶向基因和信号通路,本研究利用雌激素处理小鼠MC3T3-E1细胞并进行RNA深度测序,为深入阐述雌激素作用成骨细胞的内在作用机制提供可能。方法:利用10n Mβ-雌二醇处理小鼠MC3T3-E1细胞,3天后收集处理细胞和对照组细胞并进行RNA提取,构建两个转录组库,进行RNA测序分析,将处理结果进行生物信息分析。结果:相对于对照组,本研究在处理组中发现460个差异表达基因,在这些差异表达基因中,上调的基因有66个,下调的基因有394个。利用这些差异表达基因,本研究进行GO分类和pathway分析,发现许多骨代谢相关的生物过程和细胞信号通路紊乱。这些被富集的骨代谢相关的信号通路包括经典的TGF-β信号通路,Wnt信号通路和MAPK信号通路。其中,在TGF-β信号通路中,Tgfbr1和Bmpr1a两个关键基因的表达明显地被抑制。结论:雌激素影响了成骨细胞内骨代谢基因表达和骨代谢相关的信号通路。第三部分雌激素作用于骨代谢关键基因的分子机制研究目的:在深度测序的差异表达基因中发现Tgfbr1和Bmpr1a两个基因的表达明显被抑制。本部分深入研究雌激素抑制Tgfbr1和Bmpr1a两个基因的分子作用机制。方法:首先利用qRT-PCR验证差异表达的基因,然后利用雌激素受体抑制剂分别处理MC3T3-E1细胞,检测Tgfbr1和Bmpr1a两个基因的表达。启动子分析软件发现Tgfbr1和Bmpr1a基因的启动子,存在有雌激素受体应答原件,最后Ch IP实验验证雌激素受体β对Tgfbr1和Bmpr1a启动子的绑定作用。结果:雌激素受体β参与了雌激素对Tgfbr1和Bmpr1a基因的抑制性作用,生物信息学分析发现,在Tgfbr1的启动子区域存在3个雌激素受体应答原件,在Bmpr1a的启动子区域有2个雌激素受体应答原件。Ch IP实验证明,雌激素能够增强雌激素受体β对Tgfbr1和Bmpr1a基因的绑定性作用。结论:雌激素通过雌激素受体β抑制Tgfbr1和Bmpr1a基因的表达。