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研究背景和目的胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,胃癌术后复发转移是胃癌治疗失败的主要原因,其中腹膜转移是最常见的复发转移部位,一旦发生腹膜转移则预后极差,是胃癌死亡的主要原因。常规影像学诊断腹膜转移的假阴性率较高,常用的肿瘤标志物诊断腹膜转移的敏感性和阳性预测值均较差。诊断性腹腔镜检查联合腹腔游离癌细胞检查属于有创检查,既往有腹盆腔手术史或腹腔粘连的病人无法接受腹腔镜检查,制约了其临床应用。而且目前尚无明确的胃癌术后腹膜转移预测因子,共识认为“腹膜转移的风险因素包括TNM分期较晚(T3/T4和N阳性),淋巴结外浸润,BorrmannⅢ、Ⅳ型及Lauren弥漫型病人”。但研究发现仅25%的T3/T4和N+病人发生腹膜转移。因此仅凭借目前已知的高危因素很难较准确预测胃癌根治术后是否发生腹膜转移。医学已进入分子分型时代,肿瘤即使组织学形态相同,其基因特征可能完全不同,导致治疗和预后的差别。胃癌也是一种高度异质性肿瘤,TCGA通过高通量测序将胃癌分为四个分子亚型。但该分子分型并非基于中国人群特征(TCGA胃癌数据库中东亚人群仅占约20%),且该基因分型并没有关注腹膜转移这部分病人。因此,本课题拟通过目标序列捕获测序分析特定人群的胃癌样本(重点关注术后发生腹膜转移人群),并结合生物信息学分析、临床生存资料,筛选出预测腹膜转移的关键基因,构建相应的慢病毒介导的沉默和过表达稳转细胞株,通过体外、体内实验探究腹膜转移关键基因对胃癌细胞表型的影响。希望通过该转化性研究,为胃癌提供新的生物标志物,并为个体化治疗提供新的思路。研究方法1.全外显子组测序技术回顾性分析73例初治胃癌病人组织FFPE样本,对其中63例Ⅰ-Ⅲ期病人根据其术后是否发生腹膜转移分为腹膜转移组(PM)和非腹膜转移组(non-PM),结合临床病理、生存资料,寻找术后PM病人特征性基因突变,筛选两组间的差异基因,并构建胃癌根治术后腹膜转移的突变基因预测模型。2.结合第一部分Ⅰ-Ⅲ胃癌FFPE样本全外显子组测序和第二部分10例Ⅳ期病人外周血ctDNA 508基因测序结果,通过生物信息学分析并与临床资料比对,筛选出与胃癌术后腹膜转移最相关的基因CDC27,为后续研究奠定基础。3.IHC检测人胃癌组织中CDC27的表达并分析CDC27高表达与临床病理、生存资料之间的相关性;Western blot和RT-qPCR检测多个胃癌细胞株中CDC27的表达,根据各胃癌细胞株相对胃粘膜正常细胞GES-1的高低表达情况,分别构建慢病毒介导的shRNA-CDC27稳转细胞株和过表达CDC27稳转细胞株。4.CCK-8法、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、划痕实验及流式细胞仪PI单染法分别检测胃癌细胞CDC27沉默和过表达后增殖、克隆形成、侵袭迁徙能力和细胞周期分布的变化;通过裸鼠皮下成瘤的实验观察CDC27沉默对MGC-803胃癌细胞株裸鼠皮下成瘤能力的影响。研究结果1.针对Ⅰ-Ⅲ期胃癌术后FFPE样本进行全外显子测序后发现,术后发生腹膜转移病人(PM)与未发生腹膜转移病人(non-PM)病人在手术样本中的突变基因重合率19.7%;PM病人Ti比例、Ti/Tv、突变基因数目和TMB(肿瘤突变负荷)均明显高于non-PM病人,TMB与突变基因数目存在明显正相关;高TMB病人术后发生腹膜转移的风险明显高于低TMB组。2.PM与non-PM病人之间存在49个差异基因,从中筛选出了8个高频差异基因,携带这8个高频差异基因的病人术后发生腹膜转移的风险明显高于未携带者;单因素和多因素回归模型均证实,携带高频差异基因是胃癌术后腹膜转移的独立危险因素;根据高频差异基因和病理危险因素(T3-4)建立的腹膜转移预测模型优于单纯病理预测模型。3.10例晚期胃癌病人外周血ctDNA508基因靶向捕获测序发现,晚期腹膜转移和非腹膜转移病人之间的基因变异重合率仅3.9%,热图显示晚期腹膜转移病人有其特征性的基因突变。4.对Ⅰ-Ⅲ期胃癌术后FFPE样本和晚期病人ctDNA样本测序结果利用生物信息学并结合临床生存资料分析显示,CDC27突变与术后出现腹膜转移相关,携带CDC27突变的病人术后发生腹膜转移的风险明显增加,且CDC27突变与DFS和OS缩短相关。进一步突变位点分析发现,CDC27突变位于Apc3区、TPR区和磷酸化区,且为TCGA数据库中未收录的新突变位点。5.IHC检测发现CDC27在胃癌组织中高表达,CDC27高表达与病人淋巴结转移、肿瘤浸润深度正相关。CDC27高表达病人DFS更短,且发生术后腹膜转移的风险增高。6.Western blot及RT-qPCR检测发现CDC27在MGC-803中相对表达最高,在AGS中相对表达最低,依此成功构建稳定沉默CDC27的MGC-803_shCDC27和稳定过表达CDC27的AGS_CDC27细胞株。体外功能实验发现,沉默CDC27抑制了胃癌细胞MGC-803的增殖、克隆形成、侵袭迁徙能力,细胞周期分析显示G2/M期阻滞,S期减少。而过表达CDC27增强了胃癌细胞AGS的增殖、克隆形成、侵袭迁徙能力,细胞周期分析显示G2/M期减少,S期增加。体内实验发现,沉默CDC27使胃癌细胞株MGC-803的裸鼠皮下成瘤能力减弱。结论1.利用全外显子测序技术回顾性分析Ⅰ-Ⅲ期胃癌FFPE样本基因突变情况,发现术后发生PM的病人在手术样本中就已携带特征性的基因突变:包括突变基因数目、TMB明显增高以及携带8个高频差异基因。2.携带8个高频差异基因的病人术后发生PM的风险明显高于未携带者,为胃癌术后PM的独立危险因素。根据高频差异基因和病理危险因素(T3-4)建立的腹膜转移预测模型明显优于单纯病理预测模型。3.生信分析及临床预后分析显示,CDC27突变与胃癌不良预后及术后PM密切相关,且发现的突变位点为TCGA数据库中未收录的新突变位点。4.CDC27在胃癌组织中高表达,高表达CDC27病人具有DFS缩短和术后PM风险增高的趋势。5.体外及体内实验证实,沉默CDC27抑制了胃癌细胞MGC-803的恶性表型,过表达CDC27增强了胃癌细胞AGS的恶性表型,并可能与G2/M期阻滞,S期减少有关。6.CDC27突变及高表达均为胃癌术后不良预后因素,且CDC27突变与胃癌腹膜转移密切相关,CDC27可能可以成为胃癌新的生物标志物和潜在的治疗靶点。