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近年来,植物多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现。研究发现植物多糖具有广泛的药理作用：具有免疫调节作用,激活巨噬细胞、T淋巴细胞、LAK细胞等多种免疫细胞,促进细胞因子生成,活化补体；抗肿瘤、抗感染、抗病毒、抗消化性溃疡、抗氧化等,而且毒性相对较低,因此越来越受到研究人员的重视。本课题选择了临床上用于治疗感染性疾病的常用中草药紫草、柴胡、鱼腥草、杜仲,研究这4种传统中药多糖提取物的抗炎及免疫调节活性。本课题主要是通过检测紫草、柴胡、鱼腥草、杜仲多糖对正常健康人外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC)以及LPS活化PBMC表达炎症相关细胞因子的影响,探讨其抗炎和免疫调节活性的分子机制。我们利用real-time RT-PCR法检测TNF-α、IL-10、IFNγ、IL-4、IL-18及相关细胞因子基因转录水平,通过Western-blot检测PBMC中ERK磷酸化水平。初步结果显示,紫草等中药多糖可调节TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-18及相关细胞因子基因的转录,具有抗炎及调节天然免疫应答的功能；且紫草多糖可能是通过抑制PBMC的MAPK信号通路进而抑制LPS诱导的炎症相关细胞因子TNF-α等高表达。为紫草等中药多糖作为抗炎、免疫调节药物的临床应用提供了理论依据。一、中药多糖诱导TNF-α及IL-18等相关细胞因子的表达本实验主要观察紫草、柴胡、鱼腥草、杜仲多糖对正常健康人PBMC表达TNF-α、IL-10、IFNγ、IL-4、IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ的影响。首先用紫草、柴胡、鱼腥草、杜仲多糖分别处理PBMC,4h、24h后利用real-timeRT-PCR检测细胞因子转录水平。结果显示,与未处理组相比,紫草、柴胡、鱼腥草、杜仲多糖在处理PBMC早期(4h),均可增强PBMC TNF-α、IL-10、IL-18的转录,而抑制IL-18BP的转录；而在处理晚期(24h),对所测的细胞因子表达无明显影响。提示多糖对细胞因子转录水平的影响主要在处理早期。我们进一步检测了紫草等中药多糖处理PBMC后,不同时间点(1h、2h、6h、12h、24h)上述细胞因子的转录水平。结果显示,紫草多糖增强TNF-α的转录,2h时达高峰,是未处理组的4.1倍；柴胡多糖增强TNF-α的表达,1h时达高峰,是未处理组的6.6倍；鱼腥草、杜仲多糖均增强TNF-α的转录,6h时达高峰,分别是未处理组的7.8倍、2.1倍。紫草、柴胡、鱼腥草多糖均增强IL-10的表达,6h时达高峰,分别是未处理组的5.3倍、2.5倍、3.3倍。紫草、柴胡、鱼腥草多糖均可增强IFNγ的表达,6h时达高峰,分别是未处理组的4.6倍、5.7倍、5.2倍。柴胡多糖在处理PBMC早期,可增强IL-4的表达,2h时达高峰,是未处理组的3.9倍；紫草、鱼腥草多糖均增强IL-4的转录,6h时达高峰,分别是未处理组的2.8倍、3.5倍。柴胡、鱼腥草多糖处理PBMC,可增强IL-18的表达,2h时达高峰,分别是未处理组的2.1倍、3.3倍；而抑制IL-18BP的表达,于12h时作用最强,分别是未处理组的23.5%、31.9%。紫草多糖可增强IL-18Rα、IL-18Rβ的转录,6h时达高峰,分别是未处理组的1.8倍、2.6倍。研究证明紫草、柴胡、鱼腥草、杜仲多糖可调节TNF-α、IL-18等相关细胞因子基因的转录,具有抗炎及调节天然免疫活性的功能,且对哺乳动物细胞无明显的毒性作用,为其作为抗炎、免疫调节药物及其抗炎机制研究奠定基础。二、紫草多糖对LPS活化的PBMC表达炎症相关细胞因子的影响为了研究紫草多糖的抗炎活性,我们检测了紫草多糖对LPS活化的PBMC表达TNF-α、IL-10、IL-18、IL-8BP、IL-18Rα、IL-18Rp的影响。结果显示,LPS处理PBMC早期(4 h)可增强TNF-α、IL-18的转录,而用紫草多糖处理可抑制LPS活化的PBMC TNF-α、IL-18的表达(抑制率达15～50%)。LPS可激活MAPK通路诱导致炎因子的转录,为了研究紫草多糖抑制LPS诱导的致炎因子TNF-α转录的机制,我们用紫草多糖分别处理LPS活化的4个正常健康人PBMC,利用Western-blot检测MAPK通路中关键蛋白ERK磷酸化水平。结果显示,LPS可诱导PBMC的ERK磷酸化,紫草多糖处理可抑制LPS诱导的ERK磷酸化,抑制率达39%～73%。提示紫草多糖可能是通过抑制PBMC的MAPK信号通路进而抑制LPS诱导的致炎因子TNF-α等高表达。三、Staphylococcus carnosus作为新型HBV DNA疫苗载体的初步研究在完成上述工作的同时,我们还进行了Staphylococcus carnosus作为新型HBV DNA疫苗载体的研究。构建pkmcp／HBsAg真核表达质粒,研究了pkmcp1／HBsAg诱导机体产生的特异性免疫应答。ELISA检测免疫小鼠抗-HBs抗体滴度的结果显示,在初次免疫的第4周即可检测到抗-HBs抗体,但滴度较低(1：200),在加强免疫后4周抗体滴度达1：900,在加强免疫后第8周抗体滴度降至1：300。结果提示,pkmcp1／HBsAg质粒能够在Staphylococcus Carnosus中表达靶蛋白HBsAg,并诱导小鼠产生抗-HBs抗体,为Staphylococcus Carnosus在DNA疫苗中的应用奠定基础。