目的:急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是临床常见的由感染等多种因素引起的弥漫性肺实质损伤,也是全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)在肺部的典型表现。ALI的发病机制很复杂,迄今为止尚未完全阐明。以往研究证明机体尤其是肺部的氧化/抗氧化平衡失调在ALI的发病中起主要作用,因为当肺脏受到各种致病因素(如创伤、休克、感染等)的作用时,可导致肺脏局部产生剧烈的氧化应激反应,进而引起ALI。近来研究显示肺组织内中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)浸润是ALI发病过程中的早发事件,PMN在肺内的“扣押”是引发损伤的关键。PMN在肺内和/或循环血液中各种炎性刺激(如LPS、TNF、IL-I等)的作用下,首先扣押于肺微血管内,继而粘附于内皮细胞并被激活,然后游出肺血管床并持续活化,释放一系列损伤介质,引起肺泡弥漫性损害。P-选择素通常储存于内皮细胞的分泌颗粒中,经刺激后数分钟内即动员到内皮细胞表面,主要参与介导白细胞与内皮细胞的起始粘附。近年研究发现细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是介导PMN参与肺损伤的分子生物学基础;另有研究显示,ICAM-1可作为肺血管内皮细胞活化的标志物。因此中性粒细胞以及内皮细胞等释放大量促炎因子、炎性介质进而引起严重反应的级联放大作用,在ALI的发病过程中起着重要作用。如能有效控制炎症反应维持肺脏氧化/抗氧化的平衡,对于ALI的治疗具有重要的现实意义。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是近年来引人注目的蛋白激酶级联通路,其中p38MAPK通路与炎症反应的调控密切相关。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是生物体内重要的信号转导系统之一,是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-jun氨基未端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase, JNK)、p38和ERK5四条级联反应途径组成。每个MAPK都有自己不同的上游激酶和特异性底物,代表了对不同刺激引起细胞生理反应的一种普遍机制。从细胞外刺激作用于细胞到出现相应的生物学反应,需要通过包括MAPK、MAPKK和MAPKKK 3个关键激酶的级联反应,按照Ras-Raf(MAPKKK)-MAPKK-MAPK的顺序依次激活下游激酶,最后转位到细胞核,激活转录因子Elk、ATF2和AP-1等,启动相关细胞因子和炎性介质的基因表达。这种由多个激酶调节的级联反应,不仅使信号“瀑布”式放大,而且还通过各个激酶间的相互作用对信号进行整合,从而保证了信号的精确性和特异性。实验表明,p38MAPK通路对机体有保护性作用。但由于TNF-α、IL-1等持续高水平而导致的炎性过程可能与p38MAPK的过度激活有关,尤其在LPS诱导的多种细胞因子合成的信号转导中起到关键性作用。Beaty等实验表明p38MAPK途径介导了LPS作用的中性粒细胞内的信号转导,p38MAPK在LPS作用下被磷酸化,活化的p38MAPK即由胞浆进入胞核,转录生成大量的炎性因子。有研究已证明抑制p38MAPK途径,能够有效的抑制炎症反应。褪黑素是已发现的具有强抗氧化应激作用的激素,并在抗炎方面有积极作用,但其作用与p38MAPK途径是否相关,国内外相关文献报道甚少,其机制尚待研究。褪黑素最早认为对机体的生殖系统、内分泌系统、精神神经系统和生物节律等都有明显的调节作用,同时与睡眠、镇静等生物学行为有关。20世纪90年代初,Tan等首次报道MT具有抗氧化活性,是一种高效的内源性自由基清除剂,这将进一步扩大褪黑素在急性肺损伤方面的应用,故MT抗ALI机制仍然是目前的研究热点。但是,MT抗氧化抗炎作用的信号转导途径目前仍不十分清楚,因此从分子水平研究上述问题,为MT的广泛应用开辟更为广阔的前景。本实验通过静脉注射油酸复制急性肺损伤动物模型,旨在探讨ALI和p38MAPK信号通路活化的关系及MT抗ALI的可能机制,为MT的临床应用提供一定的理论和实验依据。方法:本实验采用尾静脉注射油酸(OA)复制大鼠急性肺损伤(ALI)模型,并通过腹腔给予褪黑素(MT)及应用p38MAPK特异性抑制剂SB203580,观察不同时间点肺组织病理学改变并采用免疫组化技术观察肺组织中P-选择素(Ps)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达变化。将84只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,随机分为7组,每组12只。(1)Control组:经尾静脉注射生理盐水(NS),每只0.2 ml/kg;(2)OA组:经尾静脉注射油酸(OA),每只0.2 ml/kg;(3)MT+OA组:经尾静脉注射油酸,每只0.2 ml/kg,并在注射前30分钟腹腔注射褪黑素(MT)20 mg/kg;(4)OA+SB203580(p38MAPK特异性抑制剂)组:经尾静脉注射油酸(OA),每只0.2 ml/kg,并在注射前30分钟尾静脉注射SB203580(5μmol/L),每只0.2 ml/kg;(5)MT+OA+SB203580组:经尾静脉注射油酸(OA),每只0.2 ml/kg,并在注射前30分钟经腹腔注射褪黑素(MT)20 mg/kg和尾静脉注射SB203580(5μmol/L),每只0.2 ml/kg;(6)MT组:经腹腔注射褪黑素(MT)20 mg/kg;(7)SB203580组:经尾静脉注射SB203580(5μmol/L)0.2 ml/kg。各组动物分别于注射油酸后观察大鼠行为学改变,并在1 h、3 h和6 h开胸经左心室取血后处死,同时留取肺部标本。肺部标本观察肺系数及形态学变化,同时采用免疫组织化学染色和图像分析观察肺组织中P-选择素(Ps)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达和分布。数据处理利用SPSS 11.5统计软件进行分析,数据均以均数±标准差(x±s)来表示,组间差异用单因素方差分析(One Way ANOVA),有显著差异者用SNK-q检验进行两两比较,均以P<0.05为有统计学意义。结果:1大鼠行为学改变OA组大鼠出现呼吸急促、精神萎靡、蜷缩成团、毛发竖起,未见摄食。2肺组织形态学改变Control组大鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺泡腔内无渗出液;OA组肺组织损伤严重,肺泡间隔明显增宽,肺泡腔及肺组织间质弥漫性炎细胞浸润;应用MT和/或OA+SB203580肺组织损伤较OA组有所减轻;单纯应用MT组或SB203580大鼠肺组织结构未见异常变化。3肺系数(肺质量g/体重Kg)各时间点OA组大鼠肺系数明显升高,与Control组比较有统计学意义(P<0.05);应用MT和/或SB203580后,肺系数有所下降(P<0.05),但仍高于Control组,有统计学意义(P<0.05);单纯应用MT或SB203580与Control组比较无统计学意义(P>0.05)。4肺组织免疫组织化学染色①Ps:Control组Ps肺脏表达的阳性信号(棕黄色)分布于气道黏膜上皮细胞,为胞浆阳性,且阳性信号较弱,血管内皮细胞未见表达;OA组各时间点的阳性信号较Control组明显增强(P<0.05),主要分布在气道黏膜上皮细胞和血管内皮细胞,均为胞浆阳性;MT+OA组、OA+SB203580组、MT+OA+SB203580组的阳性细胞分布与OA组类似,但阳性信号明显减弱(P<0.05),尤其是血管内皮细胞。②ICAM-1:Control组肺脏ICAM-1表达的阳性信号(棕黄色)分布于气道黏膜上皮细胞,为胞浆阳性,且阳性信号较弱,血管内皮细胞未见表达;OA组各时间点的阳性信号较Control组明显增强(P<0.05),主要分布在气道黏膜上皮细胞和血管内皮细胞,均为胞浆阳性;MT+OA组、OA+SB203580组、MT+OA+SB203580组的阳性细胞分布与OA组类似,但阳性信号明显减弱(P<0.05),尤其是血管内皮细胞。结论:1 OA可引起大鼠肺组织严重的炎症反应,说明成功地复制了ALI动物模型。2应用p38MAPK抑制剂SB203580可抑制P-选择素(Ps)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在肺组织内的表达,提示p38MAPK信号通路在OA诱导的ALI中发挥重要作用。3 MT对ALI时的肺脏起明显的保护作用,其保护机制可能与MT的抗氧化作用和抑制p38MAPK信号通路的过度激活有关。