流行性乙型脑炎简称乙脑,是由乙脑病毒(也称日本脑炎病毒,Japanese encephalitis virus,JEV)引起、由蚊虫传播的一种急性病毒性传染病,主要侵害中枢神经系统,对人类健康威胁很大。WHO估计,目前乙脑每年发病约50000例,其中约1/3的病例死亡,且乙脑后遗症严重,存活者20%~40%留有神经麻痹和心理改变等严重后遗症,给家庭和社会造成了巨大的经济和精神负担。近几年我国乙脑报告病例数每年在5000～10000例之间,病死率约5%-35%,且有15%的幸存者可发生严重的神经精神后遗症。尽管目前对JEV的分子生物学、免疫学特性的研究和乙脑的临床救治等取得了很大的进展,疫苗的应用也使乙脑的发病率有所下降,但是关于JEV感染的分子机制还不完全清楚。病毒受体决定了病毒的宿主范围、组织及细胞亲嗜性,并影响其致病性。一般认为JEV囊膜糖蛋白E是该病毒的受体结合蛋白(VAP),能够介导病毒与细胞的膜融合。研究发现E蛋白抗原决定簇分为三个区,即结构域Ⅰ、结构域Ⅱ和结构域Ⅲ。其中结构域Ⅱ被认为具有中和与血凝活性的表位,而结构域Ⅲ是受体的主要结合部位,能够介导病毒与细胞的膜融合。本研究利用大肠埃希菌表达了JEV的E蛋白和E蛋白的结构域Ⅲ,还构建了以JEV的E蛋白为诱饵蛋白的酵母双杂交系统,为进一步研究JEV E蛋白的结构与功能特别是与其受体蛋白的相互作用提供了物质基础。1.JEV E蛋白的原核表达及其鉴定从JEV感染乳鼠脑中提取总RNA,采用特异性引物扩增出JEV E蛋白基因。将E基因克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和序列测定无误后,再将该基因克隆到表达载体pET28a中,并转化E. coli后进行诱导表达。SDS-PAGE鉴定结果表明,在相对分子质量约53kDa处有明显的条带,与预期的6His-E融和蛋白大小一致;表达蛋白主要以包涵体形体存在于沉淀中。薄层扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的40%。采用Ni2+-NTA亲和色谱柱进行纯化,获得了纯化的JEV E蛋白。Western blot分析结果表明,表达的JEV E蛋白较好地保持了与抗JEV mAb和多抗的结合活性。2.JEV E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及其鉴定从JEV感染乳鼠脑中提取总RNA,采用特异性引物扩增出JEV E蛋白结构域Ⅲ的基因。将结构域Ⅲ的基因克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和序列测定无误后,再将该基因克隆到表达载体pET32a中,并转化E. coli后进行诱导表达。SDS-PAGE鉴定结果表明,在相对分子质量约20kDa处有明显的条带,与预期的6His-E-Ⅲ融和蛋白大小一致;表达蛋白约50%以包涵体形体存在于沉淀中,50%以可溶性形式存在于上清中。薄层扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的40%。采用Ni2+-NTA亲和色谱柱进行纯化,获得了纯化的JEV E蛋白结构域Ⅲ蛋白。采用抗his mAb进行Western blot分析,结果表明,表达的该融合蛋白较好地保持了与抗体的结合活性。3.JEV E蛋白在酵母双杂交系统中的表达及其对报告基因激活作用的检测将JEV E蛋白基因片段克隆入载体pUC19中,经酶切鉴定和序列测定无误后,再将该基因克隆到表达载体pGBKT7中,并转化入酵母菌AH109,获得了以JEV E为诱饵蛋白的酵母双杂交系统。检测该系统中JEV E对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。结果表明,带有重组表达质粒的AH109酵母菌在His营养缺陷的SD培养基上不生长,表明构建的JEV E蛋白对His3基因无激活作用;β-半乳糖苷酶印膜法及平板法检测结果也表明构建的JEV E蛋白对Lac Z基因也不具有激活作用,且对AH109无毒性。结论本实验获得的JEV E蛋白、E蛋白的结构域Ⅲ以及以JEV的E蛋白为诱饵蛋白的酵母双杂交系统,可用于JEV E蛋白的结构与功能以及与其受体蛋白相互作用的研究。