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一、目的根尖周炎（Periapical periodontitis）是一种由病原微生物引起的口腔感染性疾病,而根尖周牙槽骨的吸收则是其最终导致牙齿脱落的最主要因素之一。一旦受到外来致病菌的侵袭后,会产生一系列的炎性反应,激发骨代谢相关的信号通路,造成了破骨细胞的生成量远远大于成骨细胞,形成了骨缺损,牙齿出现脱落。研究表明根尖周炎的骨破坏可以被多种因素激活,包括细胞因子和细菌内毒素如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,LPS是革兰氏阴性细菌的细胞膜成分,在激活炎症和根尖周炎骨吸收中起着关键的作用。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）是一种多功能蛋白质,主要与骨代谢和骨重构有关。成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡是根尖周炎骨重塑过程中最关键的环节。OPN在成骨细胞和破骨细胞中高度表达,在生物矿化中具有重要作用,并参与慢性炎症和肿瘤生物学的多种生理功能。此外,OPN是一种分泌型的糖蛋白,存在多个糖基化位点及磷酸化位点,而跟OPN本身的分子功能关系密切。目前,国内外关于根尖周炎发病机制的研究主要集中于细胞因子的探索,但有关OPN在根尖周炎中作用的相关研究尚少。本课题在临床上收集人慢性根尖周炎病变组织,检测OPN是否在慢性根尖周炎中表达以及分析OPN和其他炎性因子之间的关系。建立小鼠根尖周炎动物模型,分析OPN与根尖周炎的骨破坏之间的关系。此外研究不同浓度LPS对体外培养的成骨细胞（Osteoblast,OB）、破骨细胞（Osteoclast,OC）的影响,进而探讨不同表达水平的OPN在LPS介导炎症微环境调控骨细胞分化的作用。构建去除79位N-糖链的过表达细胞株,与野生型over-OPN过表达株比较,研究N-糖链对OPN蛋白功能的影响。探讨OPN N-糖基化修饰在炎性微环境中激活NF-κB通路调控根尖周炎的骨改建的作用。为根尖周炎的发病机制提供实验依据。二、方法（一）、OPN在根尖周炎中的表达及作用1、OPN在人根尖周炎中的表达及作用（1）用Real-time PCR检测OPN与骨破坏标志因子在人根尖周炎组织中的基因表达;（2）用免疫组织化学及Western Blot检测OPN与骨破坏标志因子在人根尖周炎组织中的蛋白表达。2、OPN在小鼠根尖周炎中的表达及作用。（1）建立小鼠根尖周炎动物模型,通过Micro-CT检测动物模型建立成功;（2）提取小鼠根尖周组织总RNA,采用Real-time PCR检测OPN与骨破坏标志因子在小鼠根尖周炎中的基因表达;（3）用免疫组织化学技术检测OPN与骨破坏标志因子在小鼠根尖周炎中的蛋白表达。（二）、OPN在LPS介导炎症微环境调控破骨细胞及成骨细胞增殖分化的作用1、破骨细胞及成骨细胞诱导后细胞形态观察及鉴定（1）体外培养RAW264.7细胞加入破骨细胞诱导剂后,通过光学显微镜、Real-time PCR及TRAP染色鉴定破骨细胞是否诱导成功;（2）体外培养MC3T3-E1细胞加入成骨细胞诱导剂后,通过茜素红实验、Real-time PCR及ALP鉴定成骨细胞是否诱导成功。2、LPS对破骨细胞及成骨细胞增殖和分化的影响（1）采用不同浓度的LPS作用于诱导后的RAW264.7及MC3T3-E1细胞后,采用CCK8实验筛选出后续最佳实验浓度;（2）采用预实验筛选出的100ng/ml LPS作用于诱导后的RAW264.7细胞,采用CCK8及TRAP实验检测LPS对破骨细胞增殖和分化的影响;（3）采用预实验筛选出的1000ng/ml LPS作用于诱导后的MC3T3-E1细胞,采用CCK8及ALP实验检测LPS对成骨细胞增殖和分化的影响;（4）采用Real-time PCR和Western Blot检测LPS对破骨细胞及成骨细胞骨破坏标志因子的表达作用。3、不同表达水平OPN对破骨细胞及成骨细胞增殖、分化的作用（1）干扰OPN转染破骨细胞及成骨细胞效率验证;（2）过表达OPN转染破骨细胞及成骨细胞效率验证;（3）采用CCK8实验检测不同表达水平OPN对破骨细胞及成骨细胞增殖的作用。（4）采用TRAP及ALP实验检测不同表达水平OPN对破骨细胞及成骨细胞分化的作用。（三）OPN通过NF-κB信号通路调控骨破坏相关因子的表达1、加入NF-κB抑制剂检测OPN是否通过NF-κB信号通路调控骨破坏相关因子的表达2、用Western Blot方法检测OPN通过NF-κB信号通路调控破骨细胞及成骨细胞相关因子的表达;3、免疫荧光方法检测OPN促进破骨细胞及成骨细胞NF-κB核内移。（四）OPN N-糖基化修饰对LPS介导下成骨及破骨细胞生物学特性的影响。1、通过质谱鉴定OPN N-糖基化位点;2、利用点突变使过表达质粒的OPN蛋白第79位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,将以上质粒转入成骨细胞及破骨细胞中。3、CCK8检测OPN N-糖基化修饰对成骨细胞及破骨细胞增殖能力的影响;4、Western Blot检测OPN N-糖基化修饰对破骨细胞及成骨细胞骨坏标志因子的表达作用;5、Western Blot检测OPN N-糖基化修饰激活NF-κB信号通路调控成骨细胞及破骨细胞相关因子的表达;6、免疫荧光方法检测OPN N-糖基化促进破骨细胞及成骨细胞NF-κB核内移。结果（一）、OPN在根尖周炎中的表达及作用1、OPN在人根尖周炎中的表达及作用（1）OPN与骨破坏标志因子NF-κB、Cathepsin K及MMP9在人根尖周炎中的基因及蛋白的表达都增高;（2）OPN的表达与骨破坏标志因子NF-κB和Cathepsin K存在相关性,而与MMP9无相关性。2、OPN在小鼠根尖周炎中的表达及作用。（1）Micro-CT检测小鼠根尖周炎动物模型建立成功,Micro-CT显示成功构建了小鼠根尖周炎症模型。结果显示1-4w小鼠根尖周骨破坏量随时间推移而增大,3-4w无明显差异;（2）OPN与破骨标志因子NF-κB、Cathepsin K及MMP9在小鼠根尖周炎中的基因及蛋白的表达都增高;（3）OPN的表达与破骨标志因子NF-κB、Cathepsin K及MMP9存在相关性。（二）、OPN在LPS介导炎症微环境调控破骨细胞及成骨细胞增殖分化的作用1、破骨细胞及成骨细胞诱导后细胞形态观察及鉴定（1）体外培养RAW264.7细胞加入破骨细胞诱导剂后,通过光学显微镜、Real-time PCR及TRAP染色鉴定破骨细胞诱导成功;（2）体外培养MC3T3-E1细胞加入成骨细胞诱导剂后,通过茜素红实验、Real-time PCR及ALP鉴定成骨细胞诱导成功。2、LPS对破骨细胞及成骨细胞增殖和分化的影响（1）采用不同浓度的LPS作用于诱导后的RAW264.7及MC3T3-E1细胞后,采用CCK8实验筛选出后续实验浓度为100ng/ml LPS作用于诱导后的RAW264.7细胞及1000ng/ml LPS作用于诱导后的MC3T3-E1细胞;（2）100ng/ml LPS作用于诱导后的RAW264.7细胞,LPS促进破骨细胞增殖和分化;（3）1000ng/ml LPS作用于诱导后的MC3T3-E1细胞,LPS抑制成骨细胞增殖和分化;（4）LPS可以增高破骨细胞及成骨细胞骨破坏标志因子的表达水平。3、LPS作用下不同表达水平OPN对破骨细胞及成骨细胞增殖分化的作用（1）通过荧光显微镜及Real-time PCR验证si-OPN及over-OPN转染成功;（2）OPN可以促进破骨细胞增殖和分化反而抑制成骨细胞增殖和分化。（三）OPN通过NF-κB信号通路调控骨破坏相关因子的表达1、OPN通过NF-κB信号通路调控破骨细胞及成骨细胞相关因子的表达;2、OPN促进破骨细胞及成骨细胞NF-κB核内移。（四）OPN N-糖基化修饰对LPS介导下破骨细胞及成骨细胞生物学特性的影响。1、通过质谱鉴定OPN N-糖基化位点为第79位;2、OPN N-糖基化修饰可以促进破骨细胞增殖反而抑制成骨细胞增殖;3、OPN N-糖基化修饰通过NF-κB信号通路调控破骨细胞及成骨细胞相关因子的表达;4、OPN N-糖基化修饰促进破骨细胞及成骨细胞NF-κB核内移。结论1、OPN参与了人及小鼠慢性根尖周炎症的进展过程;2、细菌感染为主的根尖周炎中OPN的表达与破骨标志因子NF-κB、Cathepsin K及MMP9存在相关性,说明根尖周炎骨组织破坏的发生、发展过程可能与OPN有着一定的紧密联系;3、OPN影响破骨细胞、成骨细胞参与骨重塑,在LPS介导炎症微环境,OPN能促进破骨细胞的增殖及分化能力,抑制成骨细胞的增殖及分化能力;4、OPN在骨质代谢中可能起双重作用,使其成为沟通成骨细胞与破骨细胞,参与骨重塑的桥梁;5、LPS通过OPN激活NF-κB信号通路;6、OPN可加速成骨细胞及破骨细胞NF-κB p65核内移;7、OPN N-糖基化位点为第79位;8、OPN N-糖基化对OPN蛋白发挥骨细胞生物学功能至关重要。