玉米A族促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因ZmMPK4的分离及功能分析

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MAPK级联途径是真核生物中高度保守的信号通路。MAPK级联途径由MAPK、MAPKK和MAPKKK组成,通过MAPKKK-MAPKK-MAPK逐级磷酸化传递细胞信号。MAPK级联途径参与植物生长发育、细胞程序性死亡等的调节,并且能够对不同的环境刺激做出响应,如低温、高温、高盐、干旱、紫外线和病原菌的侵染等。近年来,从植物中分离到大量MAPKs,并且对其作用机理的研究也取得了长足进展。但是,其研究主要集中在双子叶模式植物,如拟南芥、烟草和紫花苜蓿等,关于玉米MAPK方面的研究相对较少,只鉴定出7个MAPK基因。本研究以玉米品种郑单958为试材,克隆和鉴定ZmMPK4基因,对其序列特征、表达模式,以及过表达转基因烟草的抗逆生理功能做了初步研究。主要结果如下:(1)从玉米中分离到促分裂原活化蛋白激酶ZmMPK4,该基因开放阅读框编码一个含有406个氨基酸的蛋白,预测的分子量为46.6kDa,蛋白序列分析发现该蛋白具有进化上保守的11个蛋白激酶催化结构域,在结构域中包含一个ATP结合位点和一个TEY基序,在C-末端还包含一个CD区。进化树分析表明,ZmMPK4属于A族的MAPK。(2)亚细胞定位软件预测,以及ZmMPK4-GFP融合蛋白瞬时转化洋葱表皮细胞实验,均表明ZmMPK4定位于细胞核。(3)ZmMPK4表达特性分析显示,该基因在玉米根、茎、叶中均有表达,在根中表达量最高,叶次之,茎中最低。NaCl、PEG、低温和高温等胁迫均能诱导叶中ZmMPK4的表达,而且外施ABA、SA、H2O2、MeJA、ETH等信号分子也均使叶中ZmMPK4的表达量增加。(4)Ca2+和H2O2均能作为细胞内第二信使起作用,RT-PCR结果表明,CaCl2预处理增强了NaCl、4C、ABA和H2O2对ZmMPK4的诱导,而EGTA预处理减弱了ZmMPK4的表达。而且咪唑、DMTU、Tiron等几种ROS抑制剂和淬灭剂预处理,均不同程度的抑制了NaCl、4C、ABA对ZmMPK4的诱导。(5)低温和盐胁迫下,过表达ZmMPK4的转基因烟草种子比野生型烟草种子萌发率高,转基因烟草幼苗的生长比野生型烟草幼苗好。(6)低温胁迫下,过表达ZmMPK4-AF的转基因烟草的种子萌发率、幼苗根长和积累的ROS与野生型相比没有明显的差别。(7)低温和盐胁迫下,过表达ZmMPK4的转基因烟草的抗氧化能力得到改善。低温和盐胁迫下,转基因烟草比野生型烟草细胞内ROS积累量少,氧化胁迫较轻,APX、CAT和POD的酶活性明显高于野生型。而且在MV处理下,转基因烟草的生长情况要好于野生型,有较多的绿色子叶和较长的根长。(8)低温和盐胁迫下,过表达ZmMPK4的转基因烟草积累更多的游离脯氨酸和可溶性糖,以及增强ROS相关基因和胁迫响应基因的表达。
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