研究背景与目的糖尿病发病率在全球呈上升趋势,其并发症糖尿病溃疡是导致糖尿病患者截肢的主要原因,造成了严重的致残率和死亡率,已经成为全球性的公共卫生问题。糖尿病溃疡伤口难以愈合是糖尿病溃疡治疗的重点和难点,传统的治疗方法效果极其有限,寻找有效的治疗糖尿病溃疡的靶点和药物已经迫在眉睫。复方黄柏液是临床上用于治疗溃疡、溃疡后创面愈合的标准化药物,但其分子机制尚不清楚;已有大量研究证明黄连素具有较好调节血糖、血脂作用,然而,其关于糖尿病创面愈合的研究很少。因此,本研究采用链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导糖尿病复合全皮层切除的糖尿病溃疡模型,探究复方黄柏液及黄连素抗糖尿病溃疡的作用及其分子机制。并利用高糖诱导的人永生化角质形成细胞（Human immortalized keratinocytes,HaCaT）损伤模型,在细胞和分子水平上进一步确证黄连素抗糖尿病溃疡的作用及其分子机制。以期为复方黄柏液和黄连素的临床应用提供理论基础,也为治疗糖尿病溃疡的新药开发和拟定抗糖尿病溃疡的保护策略提供理论依据。研究方法第一部分复方黄柏液抗糖尿病溃疡作用及分子机制研究1.采用STZ诱导的糖尿病复合全皮层切除的糖尿病溃疡大鼠模型,探究复方黄柏液对糖尿病皮肤伤口愈合的作用。采用生理盐水、复方黄柏液高低剂量及重组人表皮生长因子（Recombinanthuman epidermal growth factor,rhEGF）分别外用局部干预 13 天,于6、9、13天拍照,计算愈合率,并通过伊红-苏木素染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）、Masson染色和双光子显微镜观测复方黄柏液对其伤口愈合的影响。2.采用RNA-Seq技术对对照组（Con）、糖尿病溃疡组（STZ）和复方黄柏液干预组（STZ+HB）的大鼠溃疡皮肤组织进行转录组分析,采用生物信息学进行富集分析,聚类分析,并采用Cytoscape构建相关网络图。3.基于转录组分析和生物信息学分析的结果,利用试剂盒测定MDA表达水平;免疫荧光染色结合ELISA法检测8-OHdG表达情况;免疫荧光染色评估Caspase-3和TGF-β1的表达结果;ELISA法测定MMP9含量;通过Western blotting和免疫荧光染色的方法共同检测Nrf2及其下游基因NQO1的表达情况。采用网络药理学的方法,通过BATMAN-TCM、String等数据库,关联复方黄柏液成分与Nrf2及其下游抗氧化差异表达基因,构建“药物-成分-靶标-差异表达基因”的网络图。第二部分黄连素抗糖尿病溃疡作用及分子机制研究1.采用STZ诱导的糖尿病复合全皮层切除的糖尿病溃疡大鼠模型,探究黄连素对糖尿病皮肤伤口愈合的作用。采用生理盐水、黄连素及rhEGF分别外用局部干预12天,于第3、6、9、12天对伤口进行拍照,计算愈合率,并通过HE染色和Masson染色检测黄连素对其伤口愈合的影响。2.采用生物化学及分子生物学手段探究黄连素抗糖尿病溃疡的分子机制,利用试剂盒检测SOD、MDA和T-AOC的水平;采用免疫组织化学染色结合试剂盒测定检测Caspase-3的水平;免疫组织化学染色结合ELISA法检测TrxR1、MMP9和TGF-β1表达情况;免疫组组织化学染色检测8-OHdG和ELISA法测定TIMP1的表达,并且通过Western blotting的方法,检测p-JNK/JNK的表达情况,以阐明黄连素抗糖尿病溃疡的分子机制。3.采用高糖诱导的HaCaT模型检测黄连素对高糖诱导细胞损伤的保护作用,并采用金诺芬（TrxR1抑制剂）观察抑制TrxR1对黄连素介导的保护作用的影响,采用CCK-8法检测细胞活力;利用试剂盒测定SOD、MDA、T-AOC、GSH、ROS和p-JNK/JNK的表达情况;通过JC-1染色检测线粒体膜电位变化;TUNEL染色检测细胞凋亡;ELISA法测定TrxR1、TIMP1和TGF-β1含量;免疫荧光染色检测Ki67-细胞阳性率和p-JNK、MMP9的表达,以验证黄连素对高糖诱导细胞损伤的保护作用。研究结果第一部分复方黄柏液抗糖尿病溃疡作用及分子机制研究1.复方黄柏液具有明显促糖尿病溃疡伤口愈合作用。研究结果显示,与对照组（Con）相比,糖尿病溃疡组（STZ）伤口愈合明显延迟,经复方黄柏液和rhEGF干预6、9、13天时,伤口愈合率均显著高于糖尿病溃疡组;HE染色结果显示,糖尿病溃疡组细胞外基质分泌明显减少,复方黄柏液和rhEGF干预显著增加了糖尿病皮肤溃疡伤口细胞外基质的分泌;Masson染色和双光子显微镜观测结果显示,糖尿病溃疡组大鼠伤口胶原表达明显减少,复方黄柏液和rhEGF干预后胶原表达增加;因此,复方黄柏液具有明显修复糖尿病皮肤溃疡的作用。2.转录组测序揭示氧化应激可能是复方黄柏液抗糖尿病溃疡的关键生物学过程。RNA-Seq研究结果显示,糖尿病溃疡组（STZ）相比对照组有8469个差异基因,复方黄柏液组相比糖尿病溃疡组（STZ）显著调节6551个基因;GO和KEGG聚类分析显示,氧化应激可能是复方黄柏液修复糖尿病溃疡的关键过程;对Nrf2下游差异表达基因分析显示,STZ诱导糖尿病溃疡损伤显著抑制Nrf2下游抗氧化基因,而复方黄柏液干预增加了 Nrf2下游抗氧化基因的表达,表明复方黄柏液可能通过增强Nrf2及其下游抗氧化基因形成重要的抗氧化网络,从而抑制氧化应激损伤。3.复方黄柏液激活Nrf2及其下游抗氧化基因发挥重要的抗糖尿病溃疡作用。研究结果显示,糖尿病溃疡组（STZ）大鼠皮肤组织中,氧化产物MDA和8-OHdG水平显著增加,Caspase-3染色显著增加,Nrf2及其下游分子NQO1表达被抑制,同时显著升高MMP9、降低TGF-β1水平。复方黄柏液干预后显著降低了氧化产物MDA和8-OHdG水平,减少了 Caspase-3染色,激活Nrf2及其下游分子NQO1表达,同时显著降低MMP9、升高TGF-β1水平。表明复方黄柏液通过激活Nrf2及其下游抗氧化基因发挥抗糖尿病溃疡作用,且其作用还与提高TGF-β1和降低MMP9有关。通过网络药理学分析,复方黄柏液中的5味中药54个成分作用于169个药物靶标,进而调节Nrf2及其下游抗氧化基因,以多成分、多靶标协同作用的方式抑制氧化应激损伤。第二部分黄连素抗糖尿病溃疡作用及分子机制研究1.黄连素具有明显的促进糖尿病溃疡伤口愈合的作用。与对照组（Control）相比,糖尿病溃疡组（STZ）伤口愈合明显减缓,经黄连素干预3、6、9、12天,伤口愈合率均显著高于糖尿病溃疡组,与rhEGF组相当;HE染色结果显示,糖尿病溃疡组细胞外基质分泌明显减少,黄连素和rhEGF干预显著增加了糖尿病皮肤溃疡伤口细胞外基质的分泌;Masson染色结果显示,糖尿病溃疡组大鼠伤口胶原表达较少,黄连素和rhEGF干预后胶原表达显著增加。此外,给予抑制剂金诺芬（Aur,TrxR抑制剂）干预后,在第3、6、9、12天均显著延迟了黄连素所介导的促愈合作用,并使细胞外基质分泌和胶原生成减少。表明黄连素具有修复糖尿病皮肤溃疡的作用,其作用可被金诺芬抑制。2.黄连素通过调节TrxR1/JNK信号通路发挥抗糖尿病溃疡作用。动物实验结果显示,糖尿病溃疡组（STZ）大鼠皮肤组织中抗氧化酶T-AOC和SOD活力明显降低,MDA含量和8-OHdG水平明显升高,TUNEL染色和Caspase-3结果显示细胞凋亡显著增加,抗氧化蛋白TrxR1的表达被抑制,而增加p-JNK/JNK的表达,同时显著升高MMP9,降低TGF-β1和TIMP1水平。黄连素干预后增加T-AOC和SOD活力,降低MDA含量和8-OHdG水平,减少TUNEL染色和Caspase-3结果显示的细胞凋亡,激活抗氧化蛋白TrxR1,并降低p-JNK/JNK的表达,同时显著降低MMP9,增加TGF-β1和TIMP1水平。此外,给予抑制剂金诺芬干预后,与黄连素组（STZ+BBR）相比,T-AOC和SOD活力显著降低,MDA和8-OHdG水平明显升高,TUNEL染色和Caspase-3结果显示细胞凋亡显著增加,并且TrxR1的表达显著下调而p-JNK表达显著上调,同时显著升高MMP9,降低TGF-β1和TIMP1水平。这些结果表明,黄连素通过恢复TrxR1/JNK信号通路来减少氧化损伤和细胞凋亡以修复糖尿病溃疡创面,且其修复作用与降低MMP9、升高TGF-β1和TIMP1水平有关。3.黄连素通过调节TrxR1/JNK信号通路保护HaCaT细胞免受高糖诱导的损伤。体外细胞实验研究结果显示,高糖诱导显著降低HaCaT细胞活力,增加ROS和MDA水平,降低GSH、T-AOC和SOD活力。高糖诱导使Caspase-3活力升高、线粒体膜电位下降、TUNEL-阳性细胞率升高、Ki67-细胞阳性率降低。此外,高糖诱导减少了HaCaT细胞中TrxR1表达,并增加其下游p-JNK/JNK水平。同时,HaCaT细胞中MMP9水平显著升高,TGF-β1和TIMP1水平显著降低。黄连素干预明显缓解了高糖诱导的HaCaT细胞的损伤,减少ROS产生和MDA含量,升高GSH水平、T-AOC和SOD活力,降低Caspase-3活力、抑制线粒体膜电位下降、降低TUNEL-阳性细胞率并提高Ki67-细胞阳性率。黄连素干预激活了 TrxR1并抑制了其下游分子p-JNK/JNK的表达,同时促进TGF-β1和TIMP1的表达,抑制MMP9的表达。值得注意的是,TrxR1抑制剂（金诺芬）增加ROS水平和MDA含量、降低GSH水平、T-AOC和SOD活力,升高Caspase-3活力,降低线粒体膜电位和增高TUNEL-阳性细胞率和Ki67-细胞阳性率,剥夺了黄连素对HaCaT细胞的保护作用。此外,金诺芬的干预抑制了TrxR1并激活其下游分子p-JNK/JNK的表达,同时造成MMP9表达升高、TGF-β1和TIMP1表达降低。这些结果表明黄连素通过恢复TrxR1/JNK信号通路来减少细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,同时,黄连素促进TGF-β1和TIMP1的表达,抑制MMP9表达,进而保护HaCaT细胞免受高糖诱导的损伤。