目的:结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤,其死亡率高居第二位。以氟尿嘧啶为基础的化疗在中晚期结直肠癌治疗中尤为重要,然而高达50%患者对氟尿嘧啶产生耐药,这是导致患者治疗失败和死亡的临床难题。为探寻逆转结直肠癌氟尿嘧啶耐药,提高结直肠癌患者疗效,开展本基础研究。方法:在本研究中,我们通过“逐级递增给药法”构建了结直肠癌耐药细胞株,并对其进行转录组学测序,筛选出氟尿嘧啶耐药相关基因:肿瘤干细胞标记物DCLK1（Doublecortin-like kinase 1）。使用临床芯片和TCGA数据库分析结直肠癌耐药和DCLK1高表达之间相关性。分别使用克隆形成实验,肿瘤干细胞成球实验,流式细胞学检测肿瘤细胞表面干细胞分子标志物,检测肿瘤细胞干细胞特征,使用CCK-8增殖抑制实验,免疫荧光染色（TUNEL）,流式细胞学检测细胞凋亡比例,检测肿瘤细胞药物敏感性。同时使用蛋白质免疫共沉淀,Western blot实验检测DCLK1相互作用蛋白CCAR1,构建DCLK1分段和CCAR1突变质粒确认结合位点,使用β-catenin小分子抑制剂干预处理,明确涉及通路,使用DCLK1抑制剂处理,明确靶向DCLK1对结直肠癌耐药细胞杀伤作用。结果:通过“逐级递增给药法”构建了结直肠癌耐药细胞株,并对其进行转录组学测序,筛选出氟尿嘧啶耐药相关基因:肿瘤干细胞标记物DCLK1（Doublecortin-like kinase 1）。临床患者治疗数据和组织芯片数据显示,在以氟尿嘧啶为基础的结直肠癌治疗中,化疗耐药患者的总生存期比化疗敏感患者明显较短;而且DCLK1在氟尿嘧啶耐药患者中的表达显著高于氟尿嘧啶敏感患者,这表明DCLK1和氟尿嘧啶耐药密切相关性。在体内外功能实验中,我们证明DCLK1促进结直肠癌细胞的增殖潜能、自我更新能力及干细胞标志物表达等干细胞特性;而且DCLK1可抑制氟尿嘧啶对结直肠癌细胞的杀伤敏感性。在机制上,我们通过免疫沉淀和蛋白质谱检测发现,CCAR1是DCLK1最有潜力的结合蛋白;而且DCLK1与CCAR1结合后,通过泛素蛋白酶体途径正向调控CCAR1的蛋白水平。由于DCKL1在C末端含有一个Ca MKs激酶结构域,我们进一步研究揭示DCLK1通过C末端结构域与CCAR1相互作用,并在Ser343位点磷酸化CCAR1,这对CCAR1蛋白稳定性至关重要。鉴于CCAR1能与β-catenin结合后增强β-catenin的转录活性,我们阐明DCLK1通过CCAR1正向调控β-catenin信号通路;而且阻断β-catenin可抑制DCLK1介导的结直肠癌细胞的干细胞特性和氟尿嘧啶耐药。结论:DCLK1通过CCAR1/β-catenin途径介导的肿瘤干细胞特性,促进结直肠癌细胞的氟尿嘧啶耐药。更重要的是,我们在体内外水平证明DCLK1抑制剂可以阻断CCAR1/β-catenin途径介导的肿瘤干细胞特性,从而抑制对氟尿嘧啶耐药的结直肠癌细胞。综上所述,我们的研究表明,靶向抑制DCLK1可能是消除肿瘤干细胞和克服结直肠癌氟尿嘧啶耐药的有效治疗方法。