论文部分内容阅读
肝癌是种恶性肿瘤，恶性程度高，预后差。中国是各种肝癌的高发地，2012年全国每分钟6人确诊癌症，其中肝癌发病率排名第二[1]。在全球，我国是肝癌发生的第大国，其发病率占全球55%，死亡率占全球45%，中国目前每年约有32万例肝癌患者死亡。我国肝癌患者不仅总数世界第，发病率也是世界第。中国是乙肝大国，我国的肝癌患者大多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，高危发病人群基数极大[2]。目前的肝癌治疗手段无法从根本上改善肝癌的预后，亟待研究更有效的治疗方法用于肝癌的治疗。肿瘤干细胞的存在已经得到越来越多实验数据的支持[3-7]，肿瘤干细胞是肿瘤组织中类具有干细胞特性的肿瘤细胞，肿瘤的耐药、复发、转移和增生均与之密切相关，因此肿瘤干细胞是肿瘤治疗的关键靶标。基于此设计能够靶向杀伤肿瘤干细胞的实验方案，从而对肿瘤组织起到根本性的清除作用[8]。细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Lymphocyte，CTLs），主要通过释放穿孔素和颗粒酶来杀伤靶细胞，并能通过Fas配体介导靶细胞的凋亡。其杀伤具有特异性、连续性、高效性，是机体免疫系统清除病毒和肿瘤细胞最主要的免疫效应细胞[9]。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是体内已知最强的抗原提呈细胞，在机体肿瘤免疫反应中发挥巨大作用，DCs能够直接将初始T细胞诱导成细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Lymphocyte，CTLs），诱导特异性的免疫应答反应，从而对肿瘤细胞产生靶向杀伤作用。以树突细胞作为治疗肿瘤的生物疫苗近年来成为肿瘤免疫治疗的研究热点之[10]，相关的临床应用数据也显示出DCs作为肿瘤疫苗有良好的治疗前景，可以在定程度上改善肿瘤患者预后，提高生存率[11-32]。本课题在常规采用肿瘤细胞总RNA诱导成熟DCs的基础上，利用5型腺病毒Ad5作为载体将P53和TERT基因同时导入DCs细胞中，然后将成熟的DCs加入到初始T细胞中诱导其成为CTLs，在体外筛选和培养肝癌干细胞并检测CTLs对肿瘤干细胞的杀伤。结果成功诱导出能够高效靶向杀伤肝癌干细胞的CTLs，表明1）DCs能够诱导出针对肝癌干细胞的CTLs；2）向DCs中导入携带P53和TERT基因的病毒后能够进步提高CTLs对肝癌干细胞的杀伤活性。本实验中所采用的肿瘤干细胞是肝癌Hep3B细胞系通过实验室建立的肝癌干细胞新型培养体系诱导和筛选得来。实验中用到的5型腺病毒载体Ad5是携带有ITR序列的病毒，反向末端重复序列（Inverted TerminalRepeat，ITR）是腺病毒相关蛋白表达的顺式作用元件，通过对照实验表明携带有ITR序列的腺病毒在DCs中能够增强蛋白表达的数量并延长表达时间，因此采用携带ITR序列的腺病毒提高P53和TERT基因在DCs中的表达，相关病毒载体来自于实验室病毒载体库。本实验主要由以下五个部分组成：、树突细胞的体外诱导和培养取正常人外周血，稀释后加入含淋巴细胞分离液的分离管中，离心后在淋巴细胞分离液面之上得到含单核细胞的白膜层细胞，小心吸取白膜层细胞，清洗2-3次后用AIM-V培养基稀释，加入六孔板中，37℃、5%CO2下静置过夜，将未贴壁的细胞收集以便分离T淋巴细胞，向贴壁的细胞中加入粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素4（IL-4）和FMS样的酪氨酸激酶3（Flt3）配体，37℃、5%CO2培养第5天加入肝癌干细胞总RNA，第6天加入病毒载体，第7天加入TNF-α刺激成熟，得到成熟的DCs，通过流式检测DCs表型，结果表明DCs表达成熟DCs应有的表型CD80，CD83，CD86，HLA-DR。二、携带P53和TERT的病毒载体的选择采用表达绿色荧光的5型腺病毒载体对DCs进行感染，比较携带ITR序列和未携带ITR序列的腺病毒载体感染DCs后绿色荧光蛋白在表达强度和表达时间上的差异，结果表明携带ITR序列的腺病毒载体在MOI=20时感染DCs后对蛋白基因的表达效果最好。三、细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导树突细胞诱导和培养过程中未贴壁的白膜层细胞中主要含有B淋巴细胞和T淋巴细胞，采用尼龙毛柱过滤吸附的方法，将此未贴壁的细胞加入预处理的尼龙毛柱中，由于尼龙毛对B淋巴细胞的亲和力很大，当混合细胞液通过尼龙毛柱时，B淋巴细胞被吸附，T淋巴细胞可以通过尼龙毛柱并得到收集，收集起来的T淋巴细胞可以用于CTLs的诱导。四、肝癌干细胞和特异性CTLs的体外诱导和培养采用实验室建立的新型肝癌干细胞培养基对肝癌Hep3B细胞进行体外诱导和培养。将获得的T淋巴细胞和诱导成熟的DCs在体外进行共培养，诱导T淋巴细胞成为CTLs。通过流式检测IFN-γ的分泌比例和Elispot实验检测IFN-γ的分泌强度，结果表明诱导出的CTLs的IFN-γ分泌比例高，强度大，具有肿瘤细胞杀伤活性。五、细胞毒性T淋巴细胞在体外对肝癌干细胞的杀伤实验将两种特异性CTLs：种通过不携带病毒载体基因的DCs诱导产生；另种通过携带病毒载体基因的DCs诱导产生，分别和肝癌干细胞在体外进行杀伤实验，采用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测细胞杀伤，结果表明诱导出的CTLs对肝癌干细胞具有杀伤活性，且通过病毒携带P53和TERT基因感染DCs后再诱导出的CTLs，能够进步提高CTLs对肝癌干细胞的杀伤。结论：本课题在体外成功建立了能高效杀伤肿瘤干细胞的CTLs，通过5型腺病毒载体携带P53和TERT基因感染DCs能进步提高DCs诱导产生的CTLs对肝癌干细胞的杀伤活性。该方案综合了肿瘤基因治疗和细胞治疗的双重优势，能够在定程度上提高细胞治疗的疗效，也突出了肝癌干细胞的杀伤在肝癌治疗中的意义，有望能够成为肝癌治疗的新途径。