论文部分内容阅读
目的使用高糖联合氧糖剥夺（OGD）模型模拟体内糖尿病和脑缺血再灌注损伤模型,探讨线粒体分裂/融合失衡是否参与高糖加重缺氧对星形胶质细胞的损伤。方法本研究体外培养星形胶质细胞,为了探讨高糖和（或）低氧干预对星形胶质细胞的影响及其机制,分组为:（1）正常糖浓度未缺氧组（NG-Con）:DMEM高糖完全培养基,常氧培养箱（37℃,5%CO2）;（2）高糖培养未缺氧组（HG-Con）:加入50mmol/L葡萄糖的DMEM高糖完全培养基,常氧培养箱（37℃,5%CO2）;（3）正常糖浓度缺氧缺糖组（NG-OGD）:DMEM高糖完全培养基培养24h后,放至低氧培养箱（37℃,1%O2,5%CO2）6h,然后再放回常氧培养箱0、6、12、24h;（4）高糖培养缺氧缺糖组（HG-OGD）:含50mmol/L葡萄糖的DMEM高糖完全培养基培养24h后,放至低氧培养箱（37℃,1%O2,5%CO2）6h,然后再放回常氧培养箱0、6、12、24h。通过CCK-8法检测不同葡萄糖浓度时对星形胶质细胞的增殖活力的影响,倒置显微镜观察高糖和（或）缺氧干预后星形胶质细胞的形态变化,流式细胞术检测高糖和缺氧培养后星形胶质细胞的凋亡,DCFH-DA检测不同处理组ROS的含量,免疫细胞荧光、免疫细胞化学和Western blotting观察线粒体分裂/融合因子（Fis1、Drp1、Opa1、Mfn2）在不同处理组中的表达。结果（1）CCK-8法检测不同浓度葡萄糖对星形胶质细胞增殖活力的影响,结果为随着葡萄糖浓度的递增其细胞增殖活力呈先升高后降低的双相过程。（2）观察星形胶质细胞的密度和形态变化,倒置显微镜下可见在正常糖浓度和高糖环境中培养,缺氧后复氧时间越长,细胞密度越少;与各正常糖浓度培养组相比,相应高糖培养组星形胶质细胞的密度进一步降低,细胞间隙稀疏,还可见大量细胞变圆,在高糖培养HG-OGD/R 24h组可见大量的圆形死亡细胞和细胞碎片悬浮在培养液中。（3）流式细胞术显示在正常糖浓度培养组和高糖培养组中,缺氧和复氧后星形胶质细胞凋亡率均升高,高糖培养HG-OGD/R 12h组细胞的凋亡率升高更明显。（4）DCFH-DA法检测ROS生成结果显示与正常糖浓度未缺氧组（NG-Con）相比,正常糖浓度NG-OGD/R 24h组可检测到大量ROS生产;而高糖培养后,高糖HG-OGD/R 24h组ROS生成升高更显著。（5）免疫细胞荧光或免疫细胞化学、Western blotting结果表明:与正常糖浓度未缺氧组（NG-Con）相比,随着缺氧后复氧时间的延长,分裂因子Fis1和Drp1蛋白表达呈递增趋势,而融合因子Opa1和Mfn2蛋白表达逐渐降低;高糖培养后,Fis1和Drp1蛋白表达随着缺氧后复氧时间的延长进一步升高,而Opa1和Mfn2蛋白表达水平进一步降低,但在正常糖浓度未缺氧组（NG-Con）和高糖培养未缺氧组（HG-Con）中融合因子Opa1和Mfn2的变化没有明显差异。结论:（1）高糖导致星形胶质细胞增殖活力下降,高糖加重缺氧导致的星形胶质细胞的损伤。（2）高糖促使低氧导致的ROS产生增加,可能参与缺氧导致的星形胶质细胞凋亡。（3）线粒体分裂/融合失衡可能参与高糖加重缺氧造成的星形胶质细胞的损伤。