目前,腹泻是对生猪养殖危害较大的疾病之一,发病猪年龄越小其发病率与死亡率也越高。引起猪腹泻的病因种类繁多,如病毒、细菌、寄生虫、饲料变质、中毒和管理因素等,其中,由病毒感染引起的腹泻较为常见且难以防控。近年来,肠道冠状病毒引起的猪病毒性腹泻广泛流行、且危害较为严重。传统的猪肠道冠状病毒有猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）,而新型的猪肠道冠状病毒也不断涌现。近年来,世界多地的猪场频频发生猪肠道冠状病毒引起的腹泻疫情,2010年后再现的PEDV变异毒株、2012年首次报道的猪δ冠状病毒（PDCoV）以及2017年底在我国广东新发的猪新型α冠状病毒（PEAV）都是这些疫情的主要病原体。这几种冠状病毒导致的腹泻临床症状高度相似,且时常伴随混合感染,仅凭临床症状及病理解剖等手段基本无法鉴别诊断。为开发一种快速、高效、特异、灵敏的检测方法用于检测并鉴别诊断由猪肠道冠状病毒（TGEV、PEDV、PDCoV和PEAV）引起的腹泻,本研究拟建立四重荧光定量RT-PCR检测方法。为了实现该目标,首先分别基于TGEVN,PEDVM,PDCoV M和PEAVN基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,建立单一病原检测方法,结果显示,这四种病毒在单一实时RT-qPCR检测中最低可检至10个基因拷贝数。其次在此基础建立并优化了四重实时RT-qPCR检测方法,最低可检至100个基因拷贝数,单一和四重荧光定量PCR方法的相关系数（R2）均保持在0.99以上,扩增效率均在90%和110%之间。之后,本研究测试了优化后的四重实时RT-qPCR方法的特异性、可重复性等,结果显示,该方法特异性强,仅能出检测本研究所设计的四种猪肠道冠状病毒,与其他猪常见的猪源病毒不存在交叉反应性;该方法的批间和批内重复性高、变异率低。采用本研究建立的四重荧光定量PCR方法分别分析了本实验室于2015年10月到2018年7月期间从我国9省区市21家猪场收集的407份田间腹泻样本,并采用常规RT-PCR方法进行随机验证。结果表明重庆市的PEDV 阳性率最高,为40.2%;山东省的PDCoV 阳性率最高,为100%;宁夏的TGEV 阳性率最高,为63.6%;山东省的PEAV阳性率最高,为80%;混合感染在某些猪场较为普遍,但是TGEV和PEAV的病毒基因拷贝数都较低。上述研究结果表明,本研究建立的四重实时RT-qPCR检测方法为猪冠状病毒引起的腹泻提供了快速、高效、特异和灵敏的检测及鉴别诊断工具,该方法将有助于猪病毒性腹泻的防控及流行病学调查。