罗汉果(Siraitia grosvenorii)是我国特有的植物,主产于广西桂林,在医药、食品、保健等方面应用广泛,在国内外市场都受到极大的欢迎。但目前对罗汉果的加工利用仅仅局限于果实中少数几种成分,而其它许多有用成分并没得到充分利用,这既浪费了资源又给环境造成很大污染。此外,蛋白酶是目前工业用酶的三大主要酶制剂之一,在食品、化工、医疗、制药等方面应用广泛。而有限的蛋白酶源与逐年上升的市场需求相比已呈紧缺之势,因此有效地开发新的蛋白酶源已经迫在眉睫。本论文在前人研究的基础上进一步对罗汉果蛋白酶的分离纯化、性质、应用以及提取工艺等方面进行了深入的研究,以便更全面地了解罗汉果蛋白酶的结构、性质和特点,为开发新的蛋白酶源和有效地综合利用我国特有的罗汉果资源提供一定的科学依据。现将研究结果总结如下:一、罗汉果蛋白酶的分离纯化以鲜罗汉果为原料,经洗净,去皮,粉碎,匀浆,离心去渣,得罗汉果汁,再经50%饱和度硫酸铵盐析,沉淀透析,冷冻干燥得罗汉果粗酶。粗酶通过CM Sepharose FF离子交换、Sepahcryl S-200 HR凝胶过滤、Sepahcryl S-100 HR凝胶过滤柱层析分离,得到纯化的罗汉果蛋白酶,再将其进行SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析均显示单一的蛋白质条带或蛋白质峰。纯化后蛋白酶的酶比活为9.4×107U/g,与果汁相比蛋白酶活性回收率为4.2%,提纯倍数为31倍。二、罗汉果蛋白酶的性质研究由分离纯化得到的蛋白酶,经凝胶HPLC测定其纯度在98%以上,SDS-PAGE和Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析测定蛋白酶的相对分子质量分别约为37100D和38200D。蛋白酶的活性在pH12时最大,可将该酶归类为碱性蛋白酶。紫外光谱显示酶在220nm和280nm处有强吸收,推测在酶分子中可能存在含苯环侧链的氨基酸残基。其它酶活性测定显示该酶不具有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、过氧化物酶、淀粉酶及脂肪酶活性。此外,大豆胰蛋白酶抑制剂不能抑制该蛋白酶的活性,这也说明该蛋白酶不属于胰蛋白酶。为了探索罗汉果蛋白酶活性所必需的氨基酸侧链基团,实验用对不同的氨基酸残基有专一性作用的各种化学修饰剂与罗汉果蛋白酶反应,结果显示羟基、吲哚基和咪唑基的修饰对罗汉果蛋白酶活性有很大的抑制作用。进一步用酪蛋白作底物保护蛋白酶中的羟基、吲哚基和咪唑基,以使它们不被修饰,结果显示蛋白酶活性与保护前的酶活性相比有很大的提高。由此确定羟基、吲哚基和咪唑基参与了罗汉果蛋白酶和酪蛋白底物的结合,为罗汉果蛋白酶的活性必需基团。三、金属离子、化学试剂和表面活性剂对蛋白酶活性的影响在常见金属离子中,Cu2+对蛋白酶活性影响最大,5mmol/L的Cu2+能使酶活性降低到原来的25.8%,此外Al3+、Ni2+、Mn2+也能部分抑制该酶的活性,而其它金属离子对酶活性没有大的影响,相反Fe3+和Mg2+能激活酶的活性。0.02%的SDS和0.1%的Triton X-100、吐温80、聚乙二醇和乙二醇对有酶活性有不同的抑制作用,其中0.01%Triton X-100对该酶活性影响最大,作用后活性仅保留57%;Na2B4O7?10H2O对酶活性有很大的增强,作用后使酶活性提高0.86倍,其它常见化学试剂和表面活性剂或增稠剂对酶活性没有明显的影响。四、罗汉果蛋白酶的对其它蛋白质的水解作用和储存稳定性研究实验结果显示,与对酪蛋白有很好的底物专一性相比,罗汉果蛋白酶几乎不水解牛白蛋白、卵蛋白和胰蛋白,但对明胶、溶菌酶有一定的水解活性。罗汉果蛋白酶的稳定性研究表明,干燥、避光、低温储存和质量分数为1%半胱氨酸的添加都有利于罗汉果蛋白酶的稳定,20%的葡萄糖对储存三个星期后罗汉果蛋白酶的稳定有很好的保护作用。EDTA对罗汉果蛋白酶活性有一定抑制作用,但在储存75天后对酶活性有一定的稳定作用,以1%的浓度效果更佳。五、罗汉果蛋白酶的提取工艺研究以广西融安和荔蒲的不同生长期的鲜罗汉果为研究对象,罗汉果所含的蛋白质和蛋白酶活性随着生长时间延长逐渐增加,在一定的时间都有一个峰值,表现在不同的生长期,然后逐渐下将,而蛋白酶的比活力并没表现出明显的规律。新鲜罗汉果经洗净,破碎,水提,离心去渣,得到罗汉果汁,再经100nm陶瓷膜过滤和10,000D有机膜分离后,收集截留液经喷雾干燥得到产品罗汉果粗酶。经测定:与果汁相比,罗汉果蛋白酶活性回收率为45.4%,提纯倍数为2.67倍,浓缩了近6倍,喷雾干燥后酶活性没有明显变化。该工艺简单易行,分离快速,浓缩度和酶活性回收率都较高,对罗汉果蛋白酶的大规模生产和罗汉果的综合开发利用提供了一定的参考价值。