狂犬病是一种由狂犬病毒感染所引起的人畜共患传染性疾病,发病后死亡率约为100%,迄今为止尚未研发出针对狂犬病的有效治疗方法。狂犬病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属,是单股负链RNA病毒。狂犬病毒RNA主要编码5种结构蛋白分别为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)以及转录酶大蛋白(L)。狂犬病毒L蛋白作为一种RNA依赖的RNA聚合酶,对于病毒所有蛋白包括L蛋白本身的表达是至关重要的。L蛋白参与病毒RNA的转录过程是通过影响自身的多酶活性包括转录酶活性、加帽以及多腺苷酸化酶活性实现的,是狂犬病潜在的治疗分子靶标。核酸适配体是一种经SELEX技术筛选而得到的对靶标分子具有特异性亲和力的寡聚核苷酸,在临床治疗、诊断方面成为研究的热点。因此,狂犬病毒L蛋白核酸适配体的研究,在狂犬病毒的临床诊断和治疗中有着重要的潜在应用价值。本论文首先进行狂犬病毒重组L蛋白的表达和纯化,利用Primer5软件,从NCBI中检索出狂犬病毒L蛋白加帽酶基因序列,设计带有EcoR I和Xho I酶切位点的特异性引物。将扩增得到的目的基因插入p ET32a载体中,经过PCR和一代测序验证,成功获得重组L蛋白表达载体。狂犬病毒L蛋白基因经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测,结果表明重组蛋白大量表达。经过镍亲和株纯化、蛋白复性后即可得到大量的狂犬病毒重组L蛋白。Western blot实验结果表明成功获得分子量大小为42KD的重组L蛋白。此外,通过重组L蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,验证其与病毒感染细胞有较好的反应性,进一步间接证明所表达重组L蛋白序列正确。进而,用获得的重组狂犬病毒L蛋白进行核酸适配体的筛选。将重组狂犬病毒L蛋白固定于镍亲和柱上,基于SELEX技术进行筛选。筛选轮次至10时,将获得的单链文库连接于p MD19T中,进行克隆测序。测序结果分析后得到50条序列,其中得到4条存在重复的序列。将所得到的适配体序列利用Mfold软件进行二级结构预测,结果表明,所得适配体序列中均存在茎环结构,Apta-RABV-L-1、Apta-RABV-L-10以及Apta-RABV-L-33具有相似的结构。Apta-RABV-L-49与其他的核酸适配体的二级结构具有较大的差异。最后,基于ELONA技术对所得的四条核酸适配体进行特异性与亲和力的表征。结果表明,所得适配体对BSA、ZIKV-Pr M以及m CCL5蛋白均无交叉反应。ZIKV-Pr M和m CCL5中均含有组氨酸标签,侧面说明核酸适配体对于组氨酸标签无交叉反应。核酸适配体Apta-RABV-L-33、Apta-RABV-L-49能够特异性识别重组狂犬病毒L蛋白。Apta-RABV-L-33和Apta-RABV-L-49与靶标分子之间的解离常数KD均为纳摩级别,说明这两条适配体与重组狂犬病毒L蛋白具有较高的亲和力。此外,利用间接免疫荧光法对核酸适配体处理的N2a细胞感染狂犬病毒后N蛋白表达情况进行检测,间接免疫荧光结果表明对照组的N蛋白表达明显少于适配体处理后的实验组。证实上述适配体对于狂犬病毒增殖有一定的抑制作用。本研究成功制备了重组狂犬病毒L蛋白片段,并以重组狂犬病毒为靶标分子采用SELEX技术筛选出两条能够与靶标分子特异高亲和力结合的核酸适配体。初步鉴定,上述适配体对于狂犬病毒复制有一定的抑制作用。该适配体表现出与狂犬病毒L蛋白的高亲合力结合,与传统抗体相比具有廉价、低免疫原性、易于修饰等优点,能够为狂犬病的靶向治疗药物开发奠定基础。