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实验一:IL-17A对角质形成细胞中NF-κB信号通路活化的影响研究目的:分析白介素-17A(IL-17A)与NF-κB信号通路相关标志性蛋白(IKKβ、pIκBα、p-p65)在寻常型银屑病皮损和咪喹莫特诱导的银屑病样炎症小鼠模型皮损中的表达相关性;探索IL-17A对体外培养的角质形成细胞株(Ha Ca T)中NF-κB信号通路活性的影响;研究凉血消风汤对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中的干预效果和潜在机制。研究方法:1.临床实验:采用免疫组化检测55例寻常型银屑病患者皮损及30例正常对照组皮肤组织角质形成细胞中IL-17A、IKKβ、p-IκBα、p-p65蛋白的表达。2.细胞实验:用IL-17A刺激Ha Ca T细胞24h后,提取总蛋白,Western blot方法检测IKKβ、p-IκBα、p-p65蛋白的表达水平。3.动物实验:通过对咪喹莫特诱导银屑病样炎症小鼠模型进行凉血消风汤干预,观察小鼠模型皮损角质形成细胞中IL-17A、IKKβ、p-p65的表达情况。研究结果:1.临床实验:免疫组化染色评分分析,正常人角质形成细胞内IL-17A、IKKβ、p-IκBα、p-p65的表达水平显著低于寻常型银屑病患者皮损区角质形成细胞(P均<0.01)。2.细胞实验:与野生型Ha Ca T细胞相比,IL-17A干预24小时Ha Ca T细胞IKKβ、p-IκBα、p-p65蛋白的表达水平显著增加(P均<0.05)。3.动物实验:免疫组化染色评分分析,模型组小鼠皮损角质形成细胞中IL-17A、IKKβ、p-p65的表达显著高于正常对照组(P均<0.05);凉血消风汤低和中剂量组的IL-17A、IKKβ、p-p65表达较模型组无统计学意义(P均>0.05);凉血消风汤高剂量组IL-17A、IKKβ、p-p65表达显著低于模型组(P均<0.05)。结论:1.银屑病患者皮损角质形成细胞中IL-17A表达与NF-κB信号通路相关标志性蛋白(IKKβ、P-IκBα、p-p65)的表达升高,提示IL-17及NF-κB通路参与银屑病的发病。2.IL-17A能够上调Ha Ca T细胞中IKKβ、p-IKBa、p-p65的表达,提示IL-17可诱导Ha Ca T细胞中NF-κB信号通路的活化,表明IL-17可通过激活角质形成细胞中NF-κB信号通路参与银屑病的发病。3.凉血消风汤可以降低咪喹莫特诱导的银屑病样炎症小鼠模型皮损区IL-17A、IKKβ、p-p65的表达,提示凉血消风汤可能通过减少角质形成细胞中与炎症细胞浸润相关细胞因子(IL-17A)的表达间接抑制NF-κB通路的活化,改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样炎症。实验二:SIRT1的表达在寻常型银屑病相关炎症中的作用机制研究研究目的:检测在寻常型银屑病皮损和咪喹莫特诱导的银屑病样炎症小鼠模型皮损角质形成细胞中沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平(H3K9Ac)和p65在K310位点的乙酰化水平(Ace-K310 p65),研究SIRT1对IL-17A诱导的Ha Ca T细胞分泌炎症因子的影响,探讨SIRT1与NF-κB信号通路的互作机制及在凉血消风汤干预咪喹莫特诱导的银屑病样炎症小鼠模型中的作用及机制。研究方法:1.临床实验:采用免疫组化检测55例寻常型银屑病患者皮损及30例正常人皮肤组织角质形成细胞中SIRT1蛋白的表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平和p65在K310位点的乙酰化水平。2.细胞实验:实验分为正常对照组、IL-17A(5ng/ml)组和SIRT1 sh RNA组。通过Western blot方法检测SIRT1、IL-23的蛋白表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平和p65在K310位点的乙酰化水平。3.动物实验:建立咪喹莫特诱导银屑病样炎症小鼠模型;观察在凉血消风汤干预咪喹莫特诱导的银屑病样炎症小鼠模型中SIRT1蛋白的表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平和p65在K310位点的乙酰化水平。研究结果:1.临床实验:免疫组化染色评分分析,在55例寻常型银屑病患者角质形成细胞中,SIRT1的表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平显著低于正常人角质形成细胞(P均<0.05),但因患者病情进展不同导致皮损棘层增厚程度不一,发现随着患者皮损区棘层的增厚,SIRT1、H3K9Ac降低程度也随之增高;所有寻常型银屑病患者Ace-K310 p65显著高于正常对照组(P<0.05)。2.细胞实验:IL-17A刺激可降低Ha Ca T细胞中SIRT1的表达和H3蛋白在K9位点的乙酰化水平(P均<0.05),同时增加IL-23蛋白表达和p65在K310位点的乙酰化水平(P均<0.05);与野生型Ha Ca T细胞相比,SIRT1通过sh RNA敲低(Knockdown)后可明显增加IL-23蛋白表达和p65在K310位点的乙酰化水平(P均<0.05)。3.动物实验:免疫组化染色评分分析,模型组小鼠皮损中SIRT1的表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平显著低于正常对照组(P均<0.05),而p65在K310位点的乙酰化水平显著高于正常对照组(P<0.05);凉血消风汤低和中剂量组SIRT1表达、H3蛋白在K9位点的乙酰化水平和p65在K310位点的乙酰化水平与模型组无统计学意义(P均>0.05);凉血消风汤高剂量组SIRT1表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平显著高于模型组(P均<0.05),Ace-K310 p65显著低于模型组(P<0.05)。结论:1.寻常型银屑病患者角质形成细胞SIRT1表达及H3蛋白在K9位点的乙酰化水平显著低于正常组,p65蛋白K310位点的乙酰化水平与正常组相比显著增高,提示Ace-K310 p65、SIRT1、H3K9Ac的异常参与寻常型银屑病的发病机制。2.SIRT1增加Ace-K310 p65的表达,可能是维持NF-κB信号通路持续活化的原因之一。3.凉血消风汤通过增加SIRT1表达抑制p65乙酰化,抑制NF-κB信号通路持续活化,可能是其发挥治疗咪喹莫特诱导银屑病样炎症的作用机制之一。