长穗偃麦草AP2/ERF家族转录因子的功能研究

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:duanh
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AP2/ERF(乙烯应答元件结合蛋白)转录因子家族是植物所特有的一类转录因子,主要参与植物的细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关基因的表达调控。根据它们含AP2/EREBP结构域的数目,AP2/ERF转录因子超家族分为AP2、RAV和ERF三个家族。ERF家族含有一个AP2/EREBP结构域,又分为CBF/DREB家族、ERF家族和其他蛋白。DREB属于CBF/DREB亚族,是干旱应答元件结合蛋白,参与植物对干旱、高盐、低温、水涝等非生物胁迫的应答,调控逆境诱导基因的表达。ERF亚族基因参与植物对激素(乙烯)的分子应答反应,在非生物胁迫中也起作用。目前AP2家族基因研究最多的是模式植物拟楠芥,在抗逆性优良的野生资源植物中还很少研究。因此,加快野生资源植物中的抗逆优异基因资源的挖掘和功能验证对农作物转基因育种具有重要应用价值和理论意义。EeAP2.2和EeAP2-1.1基因是本实验室从抗逆性优良的长穗偃麦草中克隆的2个AP2/ERF家族抗逆高丰度表达基因。本研究应用生物信息学技术对EeAP2.2和EeAP2-1.1的功能进行了预测,通过半定量RT-PCR检测了高盐和干旱胁迫下二者基因转录丰度的变化,并通过转化烟草对EeAP2.2的抗逆性功能进行了初步研究,利用NMT技术表达EeAP2.2的抗逆性机理进行了探讨。同时构建了pSB187-EeAP2.2:GFP融合表达载体,并对用于转基因烟草筛选的潮霉素最适生长浓度进行了摸索。得到如下研究结果:1. EeAP2.2和EeAP2-1.1基因均含有一个保守的YRG和RAYD结构域,属于EREBP家族,EeAP2.2基因属于ERF家族中的DREB亚族基因, EeAP2-1.1基因属于ERF家族中的ERF亚族基因。2.在未胁迫条件下EeAP2-1.1在根部的表达量要明显低于EeAP2.2,干旱和高盐胁迫均能诱导二者的上调表达,胁迫4小时在根部和叶部二者的表达量均有显著增加,胁迫12小时,二者在根部和叶部的表达量持续增加,但在PEG胁迫条件下的EeAP2-1.1基因基本维持在胁迫4小时时的表达水平。3. EeAP2.2转基因烟草干旱胁迫后增加K~+内流,高盐胁迫阻止K~+和H~+大量外流,低温胁迫后H~+和K~+流速和流向出现反常,但是胁迫后恢复正常培养时野生植株全部死亡。4.转化植株的PCR检测结果显示,EeAP2.2基因成功整合到了烟草基因组中。转基因烟草植株在正常生长条件下出现矮化,平均株高降低约44%,叶片总数减少41.4%,单叶面积减小近38%,但是在开花期绿叶数增多。5.野生型烟草种子在含有250mM NaCl的MS培养基上与转基因烟草种子相比萌发缓慢,长势较弱,叶片生长缓慢;干旱胁迫30天后,野生型烟草植株矮小、叶片发黄,底部叶片枯萎,长势弱于转基因烟草。6.利用潮霉素对pSB187载体转基因烟草进行筛选的最适浓度约为4mg/L左右。
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