急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)是一种常见的心血管疾病,发病率和死亡率都较高,严重危害人类生命健康。目前临床上主要采用药物和介入等方法治疗心肌梗死,但只能缓解症状,不能修复受损心肌组织。近年来,干细胞移植治疗受到广泛关注,其中脂肪来源干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是一种从脂肪组织中提取出来并具有多向分化潜能的成体干细胞,数量多、易获取、成本低、增殖快,而且自体可取,无免疫排斥反应之忧,是用于修复心肌梗死的理想干细胞之一。然而,由于心肌梗死后心肌组织缺血缺氧产生氧化应激,导致微环境恶劣,移植后干细胞的存留和存活率普遍较低,总体治疗效果不理想。因此,利用药物提高干细胞活力、增加其抗氧化能力,或者利用生物材料支架防止干细胞弥散、并为其提供良好的三维生长微环境,进而提高移植后干细胞的存活和存留率,是提高心肌梗死疗效的重要策略。(2Z,3E)-6-溴靛玉红-3-肟((2′Z,3′E)-6-Bromoindirubin-3′-oxime,BIO)是一种具有细胞渗透性的小分子物质,可以促进哺乳动物心肌细胞增殖、抑制心成纤维细胞增殖、调节梗死后微环境,进而提高心肌梗死的治疗效果,但相关机制尚未完全清楚。文献报道BIO对干细胞的分化具有重要作用,但对干细胞是否具有保护作用,进而提高干细胞移植治疗心肌梗死的效果,尚不清楚。Matrigel基质胶是一种可注射、温度敏感性的水凝胶,含有丰富的细胞外基质,已有研究表明心肌内注射Matrigel可以提高心肌梗死后的心功能,但其与干细胞的联合应用效果鲜有报道。因此,基于以上考虑,本研究利用过氧化氢(hydrogenperoxide,H_2O_2)诱导细胞氧化应激损伤,模拟心肌梗死后的微环境,探讨BIO对H_2O_2诱导的ADSCs和心肌细胞系H9c2细胞损伤的保护作用及其机制;应用纳米材料制备负载BIO温敏纳米胶束(BIO-N),构建药物缓释系统,延长BIO对细胞的作用时间,以期提高药物的作用效果;通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型,观察ADSCs在体内的存留情况,以及BIO-N、Matrigel与ADSCs三者联合治疗对心肌梗死的治疗效果,探讨其可能机制。第一部分BIO对H_2O_2诱导ADSCs和H9c2细胞损伤的保护作用及其机制目的:探讨BIO对H_2O_2诱导ADSCs和H9c2细胞损伤的保护作用,并探讨其机制。方法:1.从SD大鼠双侧腹股沟区脂肪组织中提取ADSCs,流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD45和CD90;通过诱导分化液培养ADSCs,检测ADSCs成脂、成软骨和成骨的分化能力。2.不同浓度BIO预处理ADSCs24h后,加入800μmol/LH_2O_2作用24h诱导细胞损伤,通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,DCFH-DA染色流式细胞术检测细胞内活性氧水平(reactiveoxygenspecies,ROS),Rho123染色流式细胞术检测线粒体膜电位水平。3.在H_2O_2存在情况下,不同浓度BIO处理H9c2细胞24h,通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,DCFH-DA染色流式细胞术检测细胞内活性氧水平。CCK-8试剂盒检测BIO对心成纤维细胞的作用。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependentkinases1,CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)和细胞周期蛋白B(cyclinB)的mRNA水平。Westernblot检测MAPK通路中ERK1/2、JNK和p38的蛋白表达水平,探讨在H_2O_2存在时,BIO对H9c2细胞作用的可能机制。结果:1.ADSCs表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD90,不表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45;ADSCs能够向脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞分化,具有多向分化能力。2.BIO能够促进ADSCs增殖。BIO作用3天后,与对照组(0group)比较,BIO(1、2.5、5、10μmol/L)组的细胞活力分别增长了(11.8±7.7)%、(39.9±4.2)%、(21.2±6.6)%、(8.3±13.2)%,其中2.5μmol/L和5μmol/L两组具有明显的统计学意义。不同浓度H_2O_2损伤ADSCs24h后,细胞活力下降,在一定范围内呈浓度依赖性。根据实验结果,选用800μmol/L作为损伤浓度,建立氧化应激损伤模型。BIO预处理能够提高H_2O_2损伤后ADSCs的细胞活力。与H_2O_2组(0group)比较,BIO(0.5、1、2.5、5μmol/L)组的细胞活力分别增长了(12.9±4.1)%、(18.2±2.6)%、(18.3±1.8)%、(6.8±5.4)%,其中1μmol/L和2.5μmol/L两组具有统计学意义。BIO抑制H_2O_2诱导ADSCs损伤产生的活性氧,降低细胞内活性氧水平。BIO改善H_2O_2诱导的线粒体膜电位的降低。与对照组(0group)(100±3.1)%比较,BIO(1μmol/L和2.5μmol/L)组平均荧光强度分别为(120±9.6)%、(120±3.9)%。3.BIO能够促进H9c2细胞增殖。BIO作用3天后,与对照组(0group)比较,BIO(1、2.5、5、10μmol/L)组细胞活力分别增长了(8.2±2.1)%、(26.2±8.7)%、(23.7±10.1)%、(0.4±1.8)%,其中2.5μmol/L和5μmol/L两组具有明显的统计学意义。BIO呈浓度依赖性抑制心成纤维细胞的增殖。BIO对H9c2细胞的保护作用:在H_2O_2存在的情况下,BIO处理H9c2细胞24h,与H_2O_2组(0group)比较,BIO(0.5、1、2.5、5μmol/L)组细胞活力分别增长了(10.8±5.3)%、(17.6±5.8)%、(16.5±9.8)%、(1.2±2.1)%,其中1μmol/L和2.5μmol/L两种浓度的作用效果最明显。此外,BIO抑制H_2O_2诱导H9c2细胞损伤产生的活性氧,降低细胞内活性氧水平。H9c2细胞中cyclinD1、CDK1、CDK2和cyclinB的mRNA水平各组之间无明显统计学差异。在H_2O_2存在情况下,BIO能够促进H9c2细胞中p-ERK1/2和p-p38的表达、抑制p-JNK的表达。结论:1.BIO能够促进ADSCs增殖,预处理对H_2O_2诱导的ADSCs氧化应激损伤具有保护作用。2.BIO促进H9c2细胞增殖,对H_2O_2导致的H9c2细胞损伤具有保护作用,可能通过MAPK通路发挥作用。第二部分药物缓释系统的构建及生物相容性检测目的:制备负载BIO温敏纳米胶束(BIO-N),检测BIO-N、Matrigel与ADSCs的生物相容性,为动物实验提供理论依据。方法:1.采用透析的方法,用聚乙二醇-聚已内酯(PEG-PCL)嵌段共聚物在水中自组装成空白温敏纳米胶束;PEG-PCL与BIO共混透析,制备负载BIO温敏纳米胶束(BIO-N),构建药物缓释系统;通过紫外分光光度计检测BIO体外累积释放情况。2.通过动态/静态激光光散射仪(Dynamic/StaticLightScatteringInstrument,DLS)检测空白纳米胶束粒径、BIO-N粒径;透射电镜(TEM)观察空白纳米胶束、BIO-N的形态;扫描电镜(SEM)观察BIO-N、ADSCs和Matrigel中的微观结构。3.将ADSCs种植在Matrigel基质胶(PBS:Matrigel=1:1稀释,蛋白量约4mg/ml)中,采用Live/Dead染色和激光共聚焦显微镜观察ADSCs在Matrigel中的三维生长和增殖情况;CCK-8试剂盒检测ADSCs在Matrigel中增殖及BIO-N对其增殖的影响。4.qRT-PCR检测ADSCs中血管内皮生长因子a(vascularendothelialgrowthfactora,VEGFa)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)的mRNA表达情况。结果:1.PEG-PCL嵌段共聚物在水中自组装形成具有核-壳结构的空白温敏纳米胶束;共混透析后,疏水内核PCL将BIO包裹在内,亲水性壳PEG位于外侧,形成能够负载BIO的温敏纳米胶束(BIO-N)。PEG-PCL负载BIO后在水中形成稳定的悬浮液,BIO呈红色,收集的液体呈均匀红色,无沉淀,说明纳米胶束制备成功。BIO在BIO-N中持续释放时间长达5天,通过计算得出药物的包封率约为61.4%。2.DLS结果显示,空白纳米胶束粒径约为134nm,BIO-N胶束粒径约为270nm;透射电镜观察比较这两种胶束的形态,结果与DLS一致;扫描电镜结果显示,Matrigel成网状结构,可以将ADSCs包裹在内,而BIO-N散布在Matrigel中,粒径大小与DLS结果基本一致。3.Live/Dead染色后,激光共聚焦显微镜观察ADSCs在Matrigel三维环境中的生长情况。结果显示,不同时间点(1、3和7天)镜下只有少量细胞呈红色(死细胞),大多数细胞呈绿色(活细胞);CCK-8结果显示,与对照组相比,1天时,BIO-N能够促进ADSCs在Matrigel中的增殖,3天和7天时,这种促进增殖的效果更明显。4.qRT-PCR结果显示,BIO-N/Matrigel组能够促进ADSCs中VEGFa、EGF、Ang-1的mRNA表达,利于ADSCs在体内发挥治疗效果。结论:PEG-PCL、Matrigel两种材料与ADSCs具有良好的生物相容性,为BIO-N、Matrigel与ADSCs三者联合治疗急性心肌梗死提供重要的体外实验依据。第三部分BIO-N、Matrigel与ADSCs联合治疗急性心肌梗死的效果及其机制目的:观察BIO-N、Matrigel与ADSCs三者联合治疗急性心肌梗死的效果,并探讨其可能的作用机制。方法:1.建立急性心肌梗死模型:取体重200±15g雄性SD大鼠,用7-0无损伤缝线结扎冠状动脉左前降支,可见梗死区域心肌组织由红色逐步发白,同时心电图(ECG)显示ST段抬高,说明急性心肌梗死损伤模型构建成功。2.心肌梗死模型建立成功后,进行分组治疗:实验分组(1)MI组,注射PBS;(2)ADSCs组,将ADSCs重悬在PBS中,注入心肌梗死周边区;(3)BIO-N ADSCs组,ADSCs重悬在PBS中,并加入BIO-N;(4)BIO-N/Matrigel ADSCs组,将ADSCs BIO-N与Matrigel充分混匀后(冰上操作),注入心肌梗死周边区。ADSCs-GFP~ 追踪:从转基因SD大鼠中提取ADSCs-GFP~ ;体内细胞追踪注射ADSCs-GFP~ ,治疗3、7和14天后,将后三组大鼠麻醉处死,取出心脏样本,4%多聚甲醛固定,蔗糖梯度脱水,OCT包埋,进行冰冻组织切片,观察ADSCs-GFP~ 在体内的存留情况。免疫荧光检测不同时间点(3、7和14天)心肌组织中EGF和VEGF的表达。3.组织学观察:治疗4周后,取出心脏组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后切片,然后采用HE染色和Masson染色观察心肌梗死面积和组织纤维化比例;采用免疫组织化学方法Anti-VonWillebrandFactor抗体(vWF)染色观察血管生成情况。4.利用超声心动图检测心功能,定量分析左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)的变化。结果:1.ADSCs-GFP~ 体内追踪结果显示,ADSCs在体内的存留随着时间的推移不断减少,3天时,心肌内存留较多;7天时,细胞存留急剧减少;14天时,ADSCs-GFP~ 存留很低。通过定量分析绿色荧光区域面积比较各组ADSCs在体内的存留情况,结果显示,3天时,BIO-N ADSCs组和BIO-N/Matrigel ADSCs组绿色荧光区域面积分别是ADSCs组的1.6倍、2.4倍;7天时,两组分别是ADSCs组的1.8倍、2.4倍;14天时,ADSCs组荧光区域面积极低,两组分别是ADSCs组的4.1倍、6.5倍。与ADSCs组比较,三个不同时间点BIO-N ADSCs组荧光区域面积较大,而BIO-N/Matrigel ADSCs组荧光区域面积最大。治疗3天后,各组都无EGF表达;治疗7和14天,MI组无因子表达,但治疗组出现不同程度的EGF表达;MI组无VEGF表达;但在治疗3、7和14天后,治疗组出现不同程度的VEGF表达。2.HE染色和Masson染色结果显示,治疗4周后,与MI组比较,BIO-N ADSCs组和BIO-N/Matrigel ADSCs组心肌梗死面积分别降低了40%、55%;治疗后,胶原比例降低,心肌组织纤维化程度减轻,与MI组比较,BIO-N ADSCs组和BIO-N/Matrigel ADSCs联合治疗组胶原比例分别降低了39%、60%。3.治疗4周后,vWF染色结果显示,BIO-N ADSCs组和BIO-N/Matrigel ADSCs组血管生成数量分别是MI组的2.8倍、4.2倍。BIO-N/Matrigel ADSCs组血管生成最多。4.超声心动图结果显示,治疗4周后,与MI组比较,BIO-N ADSCs组射血分数提高了23%,改善了梗死后心功能,而BIO-N/Matrigel ADSCs联合治疗组的射血分数提高了34%,心功能改善最明显。结论:通过制备负载BIO纳米胶束(BIO-N)构建药物缓释系统,在一定程度上能够提高心肌梗死的治疗效果,而BIO-N、Matrigel和ADSCs三者联合治疗修复急性心肌梗死的效果最明显。