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背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的恶性肿瘤之一。最新数据显示,每年全球约有86万患者因结直肠癌死亡,位居肿瘤相关死亡第二位。结直肠癌患者早期无明显体征,导致诊断率低及大多数患者发现时即为中晚期,失去最佳治疗时机。经过系统性治疗的结直肠癌患者,约有50%最终会发生转移,导致治疗失败和生存率低。因此,针对结直肠癌侵袭转移机制的研究,可以实现早期预警和有针对性的治疗,提高患者诊断率和生存率,同时将为结直肠癌的诊断和治疗提供新的靶标和策略。随着研究的不断深入,循环肿瘤细胞（circulating tumor cell,CTC）在恶性肿瘤转移复发中的作用越来越受到人们重视。针对CTC进行细胞生物学和分子生物学的研究,全面认识恶性肿瘤侵袭转移和复发的机制,帮助我们理解恶性肿瘤转移与复发的原因。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）作为重要的病理生理过程,与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。本课题组前期针对CTC的研究发现,除了CTC数目与肿瘤疾病进展相关,CTC还存在EMT状态,有转移的患者间质表型CTC（CTCM）检出率远高于无转移的患者。EMT受多基因网络调控,最近发现微小RNA（micro RNA,miRNA）作为一类非编码RNA能够通过转录后调控目标基因的表达,在调控EMT中起到关键性作用,极大地影响肿瘤侵袭转移的能力。miRNA可通过与靶基因m RNA的3’非编码区（untranslated regions,UTR）结合,诱导m RNA降解或抑制m RNA翻译过程,从而造成靶基因的蛋白质水平下降。E盒结合锌指蛋白2（zinc finger E-box-binding homeobox 2,ZEB2）作为调节EMT的核心转录因子之一,在EMT发生过程中起着重要作用。我们通过生物信息学工具对EMT的核心转录因子进行分析,发现在ZEB2 m RNA的3’UTR存在miR-494-3p潜在的结合位点,miR-494-3p可能影响ZEB2的表达。因此我们推测,miR-494-3p很可能通过特异性的调控ZEB2对EMT进行调节,增加肿瘤细胞的侵袭转移能力。本研究拟在上述理论和前期研究基础上,通过临床样本、稳定转染细胞系和动物模型,系统研究和分析miR-494-3p对结直肠癌侵袭转移的影响及其调控ZEB2/EMT信号通路的作用,从体外和体内水平探讨其对结直肠癌的发生发展的影响,以期为结直肠癌的早期诊断和治疗提供新线索。第一部分miR-494-3p和ZEB2在结直肠癌组织中表达情况及其相关性研究目的:研究结直肠癌组织中miR-494-3p和ZEB2的表达情况及其相关性。方法:收集2016年1月到2017年6月在武汉大学中南医院确诊并行根治性手术的结直肠癌患者60例,取其侵袭前缘及其配对的肿瘤中心组织。利用免疫组化、Western blot和q RT-PCR的检测方法,对结直肠癌组织侵袭前缘和肿瘤中心的miR-494-3p和ZEB2表达水平进行评估,分析二者的表达差异及其相关性。同时,分析结直肠癌组织侵袭前缘中miR-494-3p和ZEB2表达水平与临床病理参数、CTC/CTM及CTCM的关系。结果:结直肠癌组织样本检测结果显示,侵袭前缘中miR-494-3p表达水平显著低于肿瘤中心,但侵袭前缘中ZEB2的表达量明显高于肿瘤中心。皮尔森相关性分析结果显示,在侵袭前缘中miR-494-3p与ZEB2的表达水平呈显著负相关（R~2=0.444,P<0.001）。然后我们分析了结直肠癌组织侵袭前缘中miR-494-3p和ZEB2表达水平与临床病理参数的关系,结果表明侵袭前缘中miR-494-3p低表达与肿瘤大（P=0.020）、分化差（P=0.004）、淋巴结转移（P<0.001）和TNM分期更晚（P=0.008）显著相关,ZEB2高表达与浸润深度更深（P=0.015）、淋巴结转移（P=0.003）和TNM分期更晚（P=0.001）显著相关。进一步分析发现,结直肠癌组织侵袭前缘中miR-494-3p低表达和ZEB2高表达与CTC/CTM+相关;CTCM检出率与miR-494-3p表达量呈负相关,与ZEB2表达量呈正相关。结论:miR-494-3p在结直肠癌组织侵袭前缘中低表达,与ZEB2的表达水平呈负相关,二者可能存在调控关系,影响结直肠癌的侵袭转移。第二部分miR-494-3p对结肠癌细胞生物学行为的影响目的:探讨miR-494-3p在体外和体内异常表达对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法:根据结肠癌细胞中miR-494-3p的表达量不同,选取合适的细胞转染质粒构建稳定转染细胞系,探讨miR-494-3p对结肠癌细胞生物学功能的影响。采用CCK-8和克隆形成实验,检测miR-494-3p对结肠癌细胞增殖能力的影响。采用划痕实验Transwell实验,检测miR-494-3p对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。通过裸鼠皮下成瘤实验检测在体内环境中miR-494-3p对结肠癌细胞成瘤能力和侵袭能力的影响。通过裸鼠尾静脉成瘤实验检测在体内环境中miR-494-3p对结肠癌细胞形成转移能力的影响。结果:选取miR-494-3p高表达细胞系HCT116转染质粒miR-494-3p inhibitor与NC,选取miR-494-3p低表达细胞系SW480转染质粒miR-494-3p与NC,构建稳定转染细胞。检测稳定转染细胞系的转染效率,结果显示,与对照组相比,miR-494-3p inhibitor组中miR-494-3p表达水平显著下调,miR-494-3p过表达组中miR-494-3p表达水平显著上调。CCK-8结果显示,在48h和72h时,miR-494-3p inhibitor组中HCT116细胞的OD值明显高于对照组;而miR-494-3p过表达组中SW480细胞的OD值明显低于对照组。克隆形成实验结果显示,miR-494-3p inhibitor组中HCT116细胞的克隆形成明显多于对照组;而miR-494-3p过表达组中SW480细胞的克隆形成明显少于对照组。划痕实验结果显示,与对照组相比,在48h后,miR-494-3p inhibitor组中HCT116细胞的运动能力明显增强;而miR-494-3p过表达组中SW480细胞的运动能力受到明显抑制。Transwell实验结果显示,与对照组相比,miR-494-3p inhibitor组中HCT116细胞的迁移和侵袭的细胞数目明显增多;而miR-494-3p过表达组中SW480细胞的迁移和侵袭的细胞数目显著减少。裸鼠皮下成瘤实验结果表明,与对照组相比,第20天开始miR-494-3p inhibitor组肿瘤体积和重量显著增加;进一步分析发现,miR-494-3p inhibitor组CTC检出数目显著增多。裸鼠尾静脉成瘤实验结果表明,第25天开始miR-494-3p inhibitor组裸鼠重量较前不增加反而减低,且显著低于对照组;进一步分析发现,miR-494-3p inhibitor组肝转移率（4/6,66.67%）较对照组（2/6,33.33%）有所增加,miR-494-3p inhibitor组肺转移率（3/6,50.00%）较对照组（1/6,16.67%）亦有所增加。结论:在体外,miR-494-3p被抑制后可增强结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,miR-494-3p过表达可抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。在裸鼠体内,miR-494-3p被抑制后增强肿瘤的生长,促进CTC的形成,增加肝和肺转移的几率。第三部分miR-494-3p靶向ZEB2调控结肠癌细胞EMT信号通路机制研究目的:miR-494-3p可靶向作用于ZEB2 m RNA的3’UTR,抑制结肠癌细胞中ZEB2的表达并调控EMT信号通路。方法:利用生物信息学工具预测miR-494-3p是否可靶向作用于ZEB2。采用双荧光素酶报告基因检测的方法,测定转染后细胞的荧光素酶活性,根据检测结果判定miR-494-3p与ZEB2 m RNA的3’UTR是否相结合。利用第二部分构建的稳定转染细胞系,检测转染后的细胞中ZEB2及EMT相关标志物的表达水平。利用免疫组化、Western blot和q RT-PCR,检测裸鼠皮下肿瘤组织中ZEB2及EMT相关标志物的表达水平。应用si RNA在稳定转染细胞系中干扰ZEB2的表达水平,检测结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,以及EMT相关标志物的表达水平。结果:通过生物信息学工具预测,ZEB2 m RNA的3’UTR在5001-5008位点序列与miR-494-3p序列有8个碱基对的匹配。根据上述位点的匹配情况,设计了野生型质粒载体pmir GLO-ZEB2-WT和突变型质粒载体pmir GLO-ZEB2-MUT,与hsa-miR-494-3p mimics和NC共转染导入HCT116和SW480两种细胞中,结果发现与对照组相比,hsa-miR-494-3p mimics能够抑制野生型质粒组细胞中荧光素酶活性,但在突变型质粒组中细胞荧光素酶活性无统计学差异。放线菌素D实验结果表明随着时间的推移,miR-494-3p过表达组ZEB2 m RNA的表达水平较对照组显著下调,miR-494-3p过表达组ZEB2 m RNA的半衰期（T1/2=2.122h）较对照组（T1/2=4.835h）显著缩短。检测稳定转染细胞系HCT116（miR-494-3p inhibitor和NC）中ZEB2及EMT相关标志物的表达情况,q RT-PCR检测结果显示,与对照组相比,miR-494-3p inhibitor组ZEB2 m RNA表达水平显著上调;Western blot检测结果显示,与对照组相比,miR-494-3p inhibitor组ZEB2蛋白表达水平显著上调,ZEB1蛋白表达水平无明显变化,E-cadherin蛋白表达水平显著下调,Vimentin蛋白表达水平显著上调,诱导EMT。稳定转染细胞系SW480（miR-494-3p和NC）中结果恰好相反。裸鼠皮下肿瘤组织检测结果显示,与对照组相比,miR-494-3p inhibitor组ZEB2表达水平显著上调,ZEB1表达水平无明显变化,Ki-67表达水平显著上调,E-cadherin表达水平显著下调,Vimentin表达水平显著上调,诱导EMT。在稳定转染细胞HCT116中转染si-ZEB2后,结果表明,与对照组相比,沉默ZEB2后HCT116细胞的OD值显著降低,克隆形成显著减少,迁移和侵袭的细胞数目显著减少;ZEB2表达水平显著下调,E-cadherin表达水平显著上调,Vimentin表达水平显著下调,抑制EMT。结论:miR-494-3p可靶向作用于ZEB2 m RNA的3’UTR,影响ZEB2 m RNA的稳定性,抑制结肠癌细胞中ZEB2的表达调控EMT信号通路。