遗传性牙本质发育不全（Dentinogenesis imperfecta，DGI）是一种常染色体显性遗传病，发病率为1/8 000。临床上将其分为三型：Ⅰ型 （DGI-Ⅰ），患者除牙本质生成不全外，还伴有成骨发育不全的症状；Ⅱ型 （DGI-Ⅱ），即传统所说的牙本质发育不全，又名遗传性乳光牙本质；Ⅲ型（DGI-Ⅲ），又名白兰地型牙本质发育不全，为孤立发生于马里兰州的3个隔离民族群中的特殊的遗传性乳光牙本质。目前，DGI-Ⅰ的病因已经查明，为广泛的Ⅰ型胶原基因突变，而DGI-Ⅲ的发病人群有限，因此DGI-Ⅱ的研究成了当前的一个重点。1 遗传性牙本质发育不全Ⅱ型致病基因的定位研究 随着DNA遗传标记的不断丰富，DGI-Ⅱ的基因定位工作也取得了一系列的进展。目前国外学者已将DGI-Ⅱ的致病基因定位于4q21区域GATA62All和D4S1563之间遗传学距离为2cM的范围内。为了考察DGI-Ⅱ致病基因在我国患者中的定位情况，本研究选用该区域的9个微卫星DNA标记对中国江苏的两个牙本质发育不全Ⅱ型家系进行了连锁分析，结果家系A在位点GATA62A11、DSPP、DMP1、SPP1和D4S1536最大Lod值均大于3，得到肯定连锁的证据；家系B在位点GATA62A11、SPP1、D4S1563和D4S1647最大Lod值均大于1，支持连锁，位点DSPP在两点连锁分析时Lod值小于0，但进一步的多点连锁分析证实DSPP与疾病也是连锁的。通过分析两个家系的单体型，致病基因被定位在D4S1534和D4S2623两个多态位点之间，与国外报道的区域相似。一＿ ZAY胚C删文库的构建 为了进一步筛选候选区域的编码序列，寻找更多的候选基因，本研究采用 了构建CDNA文库的方法。由于DG工 11的主要表现是牙本质的生成和矿化紊乱， 而牙齿的发育始于胚胎时期，因此构建人牙胚cDNA文库将有助于寻找参与牙 齿形成和矿化的基因。本研究选取7月龄胎儿乳牙牙胚，抽提总RNA，并分离 InRNA，建库采用 SmartcDNA Library Construction Kit （Clontec公司）试 剂盒进行。InRNA经反转录生成cDNA，并进行PCR扩增，扩增产物酶切后与噬 菌体载体（入 TripIExZ）相连，并进行包装，以兀亿 为受体菌滴定文库。 测定结果显示所构建的文库库容量为 0．8 XI 06 Pm／Inl，重组率为 83儿牙胚 cDNA文库的构建为进一步筛选候选区域的编码序列提供了方便。 3 瞅基因的突变筛选 随着人类基因组遗传图谱和物理图谱的不断完善，已经被定位的基因越 来越多，因此可以直接从GDB中检索致病区域内的所有己知基因，根据它们的 功能来选择作为候选基因，进行致病突变的筛选，这一策略又称为定位候选克 隆。4qZI区域的己知基因包括BSP、SPPI、DMPI和DSPP等，这些基因均与组 织矿化有关，并且均在牙齿发育过程中有表达，因此都先后被归入了候选基因 之列。目前国外学者己经证实，BSP、SPPI、DMPI不存在突变，而 DSPP尚未 见报道。为避免漏检，我们对该区域的基因均进行了突变检测，本文只报道了 DMPI和DSPP。 检测结果发现：DMPI的E－con6存在一个G—A的变化，但编码的氨基酸并 未改变，仍为谷氨酸（Gin），属于同义突变（sane senne mutation）。其余未见 任何致病性改变，因此排除了DMPI作为DGI－11致病基因的可能性，与国外学 者的报道一致。 在DSPP基因的E－con4－5中也存在一个G—A的变化，编码的氨基酸由天冬 ，4· 第四军医大学俗士学位论文 氨酸（Asp）变成天冬酚胺（Asn），但考察该变异在DG工 11患者、正常人中的分 布，却并未发现疾病特异性，正常人群中也存在这一变异，因此我们认为该位 点属于一个单核昔酸多态。 在DSPP基因的E－con3中，A、B两个DG工 11家系分别在不同的位点发 生了突变。A家系的突变（G—A）发生在第3外显子与第3内含子交界处的剪接 部位，5，端的剪接供体位点由 GT变为 AT，使其失去了识别特征，造成该位点 的不剪接，其结果可能会引起第3外显子的丢失。而在B家系，突变发生在编 码区域，氨基酸由濒氨酸（Val）变成苯丙氨酸（Phe）。该位点的濒氨酸在人、 大鼠和小鼠中具有高度的保守性，并且此区域可能为蛋白质的跨膜区域，因此 这一位点的突变可能会影响信号肽的裂解，从而影响DSPP的功能，进而影响 牙本质的正常形成。由于这两个突变均为疾病特异性的，正常人群中不存在这 两种变异，因此得出结论DSPP是DGI 11的致病基因。 DGI刁致?