癌痛是临床晚期癌症患者最常见的症状之一,一半以上的癌症患者会经历剧烈且很难控制的疼痛,虽然吗啡等阿片类药物对癌痛的疗效显著,但是,伴随成瘾性、胃肠道反应等副作用。因此,缓解疼痛是临床医生面临的最大的难题。癌痛是一个复杂的病理学过程,同时也是临床上的一大难题。癌痛属于慢性疼痛的范畴,与炎症痛和神经病理性疼痛机制相比,有相似之处,也有其独特而复杂之处。所以建立合适的动物模型对于深入的研究癌痛机制就显得非常重要。自1999年Schwei首次报道了小鼠骨癌痛模型以来,其它癌痛动物模型也相继产生,这将对癌痛机制的深入探讨、寻找缓解癌痛新方法、筛选有效的镇痛药物提供极为有效的途径。为了给临床上癌痛的治疗提供更可靠、有效的方法,研究者通过构建适当的骨癌痛动物模型进行对癌痛的机制和治疗的基础研究。中药镇痛是祖国医学的伟大智慧结晶,因作用广、毒副作用小并而且经济简便而普遍被患者接受。国内外大量研究表明,中药对急性或者慢性疼痛都能起到一定的镇痛作用。临床实践表明,中药用于癌痛病人,不仅能够镇痛,还能通过调节癌症患者的免疫功能,从而达到提高癌症患者生活质量的治疗目的。但是长期以来,由于缺乏合适的癌痛实验动物模型,阻碍了对癌痛机理的研究,同时也影响了新型有效的癌痛治疗方法的研究,包括一些癌痛新药及针刺等非药物治疗的方法。相关实验数据表明,神经胶质细胞与慢性疼痛密切相关。胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)在主要的痛觉传递物质中起着重要的作用。此外,胶质细胞释放出的致炎细胞因子(包括TNF-α、IL-1β、IL-6等)都是引起痛觉传递神经元敏化的主要因素,促进中枢敏化的形成。由此可见,胶质细胞在痛觉的初级传入和发展过程中至关重要,以及在痛觉调节特别是疼痛中枢敏化的形成与维持中举足轻重。芷辛方是河南省中医药研究院著名研究员张海岑50多年的临床经验方,芷辛方由白芷、细辛、川芎等药物组成,具有温经通络、活血化痹、祛风止痛的功效。经临床研究证实,芷辛方用于治疗包括骨癌痛在内的多种痛症,效果显著。综上所示,本论文开展以下研究：1.参照以往文献报道建立癌痛动物模型以寻找有效缓解疼痛的方法,并进一步探讨芷辛方的镇痛作用。通过对模型大鼠体重、胫骨病理、胫骨X光片、后肢热痛觉过敏、机械性痛觉超敏(触诱发痛)以及自发性疼痛的研究对模型进行综合评估。2.观察癌痛时大鼠脊髓内胶质细胞以及相关机制作用下指标的变化。1)用免疫组化对各组大鼠胫骨癌痛时脊髓星型胶质细胞标志蛋白GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein,胶质纤维酸性蛋白)进行检测；2)用Western Blot对各组大鼠胫骨癌痛时脊髓NF-κB (Nuclear factor-kappa B,核因子κB)和SIGIRR进行检测；3)用RT-PCR对脊髓小胶质细胞标志性蛋白CDllb和Toll受体2(TLR2)及4(TLR4)进行检测；4)用酶联免疫吸附法(ELISA)对各组大鼠胫骨癌痛时致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6进行检测。结果如下：1.骨癌痛模型的建立通过对大鼠左胫骨内接种含有3x103个Walker256嫁接的腹水瘤细胞液造模,实验结果所示,骨癌痛模型组与空白组体重显示非常显著性差异,且骨癌痛模型组的体重增加迟缓甚至呈下降趋势(P<0.01)。骨癌痛模型组比空白组动痛大鼠自发性运动呈现出非常显著性差异,且明显呈上升趋势(P<0.01)。和空白组相比较,机械痛觉超敏骨癌痛模型组与空白组相比呈现出非常显著性差异,且明显的下降趋势(P<0.01)。和空白组相比较,大鼠模型组手术侧胫骨的X线影像以及HE染色显示骨结构发生明显改变和破坏。2.大鼠胫骨癌痛时脊髓背角胶质细胞功能活动变化实验分为空白对照组、骨癌痛模型组、西药对照组(盐酸曲马多,10μg·kg-1)、中药对照组(五灵止痛胶囊,60『g·kg-1)、高剂量芷辛方治疗组、正常剂量芷辛方治疗组、低剂量芷辛方治疗组(芷辛方高、中、低水煎浓缩制剂分别为9g·kg-1、4.5g·kg-1、2.25g·kg-1生药／只),并于造模14d后开始灌胃,每日一次,连续7d。第21d,取各组大鼠血清、手术侧胫骨及其脊髓腰膨大段(L4-L6),并对其组织进行免疫组织化学、Western Blot、RT-PCR等形态学及分子生物学技术检测。1)免疫组化检测骨癌痛模型组的髓内星形胶质细胞的标记蛋白GFAP,呈现明显升高,且明显多于空白组、芷辛正常剂量组和芷辛高剂量组。骨癌痛发生时,星形胶质细胞增生肥大,芷辛方对其具有抑制镇痛作用。2)PCR检测小胶质细胞标志性蛋白CD11b,骨癌痛模型组的CD11b mRNA明显高于芷辛正常剂量和芷辛高剂量(P<0.01)。表明骨癌痛时,小胶质细胞表现为增殖活化,芷辛方对其有抑制镇痛的作用。3)芷辛方干预治疗的骨癌痛组的中枢神经系统免疫活性重要因子TLR2、TLR4mRNA与骨癌痛模型组出现显著性差异(P<0.05)。骨癌痛模型组的NF-「B/GAPDH的蛋白水平与正常组和芷辛高剂量组的表达出现显著性差异(Y<0.05)。结果显示,中枢疼痛TLR-NF-κB信息通路被激活,芷辛方通过对TLR的抑制从而达到对其下游通路的抑制和治疗作用,进而达到止痛的效果。4)骨癌痛模型组髓内的SIGIRR(Single Ig IL-1-related receptor,单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白)蛋白表达与芷辛高剂量组、芷辛正常剂量组的表达出现非常显著性差异(P<0.01),这与NF-κ B的结果相反。实验发现,芷辛高剂量组的表达高于空白组,而芷辛正常剂量组的表达与西药组接近。提示着芷辛方通过对SIGIRR的活化从而达到对NF-κB的抑制作用,这可能是芷辛方降低和治疗癌痛的机制之一。5)大鼠胫骨癌痛时致炎因子TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α,肿瘤坏死因子-α)、IL-1β(Interleukin-1beta,白细胞介素-1beta)、IL-6(Interleukin-6,白细胞介素-6)的表达变化芷辛方高剂量治疗组、空白组的IL-1β表达低于骨癌痛模型组,存在非常显著性差异(P<0.01),而芷辛方正常剂量治疗组的IL-1β表达与骨癌痛模型组,存在明显的差异(P<0.05)。不仅如此,芷辛方高剂量治疗组、空白组的IL-6、TNF-α表达低于骨癌痛模型组,存在非常显著性差异(P<0.01)；芷辛方正常剂量治疗组的的IL-6与骨癌痛模型组存在明显的差异(P<0.05)。结论：骨癌痛发生时,脊髓水平胶质细胞的增殖活化与TLR-NF-κB通道的激活是致痛机制之一；与此同时,SIGIRR表达的降低可能与骨癌痛的发生机制相关。芷辛方具有镇痛作用,通过对SIGIRR的活化增生,降低和抑制脊髓水平胶质细胞的增殖活化以及TLR-NF-κB信号通路的激活可能是其机制之一。